一種快速檢測表皮葡萄球菌的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種快速檢測表皮葡萄球菌的方法，具體為 一種表皮葡萄球菌的特異基因的發現及其應用于表皮葡萄球菌檢測技術方法的建立。
【背景技術】
[0002] 表皮葡萄球菌是存在于皮膚表面的條件致病菌，其引起敗血癥，慢性前列腺炎的 趨勢以日俱增。表皮葡萄球菌的耐藥現象非常嚴重，臨床上治療表皮葡萄球菌所致疾病較 為棘手。因此，快速檢測出表皮葡萄球菌就顯得尤為重要。
[0003] 目前臨床應用的表皮葡萄球菌的檢測方法有常規涂片鏡檢法、培養法、免疫學測 定、儀器自動分析鑒定系統等，但是這些方法都存在一定的缺陷，如常規涂片鏡檢是最基本 的細菌學檢查方法，但是敏感性低，特異性差；培養法是目前臨床上發現傳染源的主要途徑 和手段，但其非常耗時，不能實現快速的目的；免疫學測定方法對培養基的含鹽量有很高的 要求，若含鹽量比較高，那么蛋白的合成會受到抑制，而出現假陰性；近年來，儀器自動化分 析鑒定系統不斷面市，但這些鑒定系統大多數應用面較窄，費用昂貴。
[0004] 本發明利用生物信息學尋找出表皮葡萄球菌特異基因，并針對其設計引物，建立 了表皮葡萄球菌的檢測方法，實現了簡便、快速、準確的檢測出表皮葡萄球菌的目的。
【發明內容】
[0005] 本發明針對現有技術對表皮葡萄球菌檢測技術的缺陷，目的在于提供一種高特異 高敏感檢測的快速檢測表皮葡萄球菌的方法，通過物信息學手段獲取可用于鑒定表皮葡萄 球菌的基因，并設計可以特異性檢測表皮葡萄球菌的引物，利用聚合酶鏈式反應鑒定表皮 葡萄球菌的方法。
[0006] 本發明具體通過以下技術方案實現：
[0007] -種快速檢測表皮葡萄球菌的方法，通過生物信息學手段獲取用于鑒定表皮葡萄 球菌的基因，并針對該基因，設計上游引物如SEQ ID NO: 1所示，下游引物如SEQ ID NO :2 所示，進行PCR擴增，擴增產物在瓊脂糖凝膠中電泳，獲得檢測結果。
[0008] 本發明所述的鑒定表皮葡萄球菌的基因為DeoR family transcriptional regulator，該基因 Genbank登陸號為3240916,為表皮葡萄球菌特有，基因序列如SEQ ID NO : 3所示。
[0009] 本發明所述的PCR反應體系為：25 μ L，Taq 0. 125 μ L，10 X聚合酶緩沖液2. 5 μ L， dNTP 2 μ L，Mg2+L 6 μ L，模板 1 μ L，上下游引物各 1 μ L，加 CldH2O 補足 25 μ L。
[0010] 本發明所述的PCR反應程序為：1)預變性：95°C 5min ;2)30個循環：95°C 30s， 59°C 30s，72°C 20s ;3)后擴增：72°C lmin。
[0011] 本發明快速檢測表皮葡萄球菌的方法在Mg2+為I. 6mM，退火溫度為59°C條件下進 行。
[0012] 所述引物組合物與鑒定表皮葡萄球菌的基因的246位至705位的核苷酸序列或其 互補鏈互補。
[0013] 本發明還提供了一種用于應用聚合酶鏈式反應鑒定表皮葡萄球菌的引物組合物， 所述的引物組合物為：上游引物如SEQ ID NO: 1所示，下游引物如SEQ ID NO :2所示。
[0014] 本發明還提供了基因 DeoR family transcriptional regulator (Gen bank 登陸 號為3240916)用于鑒定表皮葡萄球菌的用途。
[0015] 本發明的有益效果為通過本地Blast比對和分析，獲得表皮葡萄球菌的特異基 因，針對特異基因設計特異引物，該引物可以快速、簡便、準確的檢測表皮葡萄球菌。
【附圖說明】
[0016] 圖1是不同退火溫度和Mg2+濃度下檢測表皮葡萄球菌電泳圖；A為退火溫度49°C; B為退火溫度51°C ;C為退火溫度53°C ;D為退火溫度55°C ;E為退火溫度57°C ;F為退火溫 度 59°C ;M 為 2000bp marker，1 ~5 依次為 0· 8、L 6、2. 4、3. 2、4. OmM ;
[0017] 圖2是Mg2+為1.6mM、退火溫度為59°C的條件下檢測表皮葡萄球菌電泳圖；M為 2000bp marker，1至3為三株表皮葡萄球菌，4為肺炎克雷伯菌，5為弗勞地氏枸櫞酸桿菌， 6為傷寒桿菌，7為瓊氏不動桿菌，8為大腸桿菌，9為糞腸球菌，10為溶血葡萄球菌，11為金 黃色葡萄球菌，12為摩氏摩根菌；
[0018] 圖3是檢測不同表皮葡萄球菌濃度的電泳圖；M為2000bp mar ker，0至9分別為 為100個/ μ L至109個/ μ L，C為陰性對照。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明做進一步的說明，以下所述，僅是對本發明的較佳實施 例而已，并非對本發明做其他形式的限制，任何熟悉本專業的技術人員可能利用上述揭示 的技術內容加以變更為同等變化的等效實施例。凡是未脫離本發明方案內容，依據本發明 的技術實質對以下實施例所做的任何簡單修改或等同變化，均落在本發明的保護范圍內。
[0020] 實施例1
[0021] 一種快速檢測表皮葡萄球菌的方法，具體通過以下步驟完成：
[0022] 一、特異性靶基因篩選及引物設計
[0023] 從 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genome/)中下載的表皮葡萄球菌全基 因組序列，對本地的核酸數據庫進行本地BLAST檢索，獲取得到表皮葡萄球菌各序列片段 與數據庫比對結果。
[0024] 使用在線BLAST功能，使用2種策略確認其菌種特異性和表皮葡萄球菌鑒定可 用性。一種策略為BLAST時排除表皮葡萄球菌，結果顯示無任何相似序列者為表皮葡萄 球菌特異基因；第二種策略為BLAST時選擇在表皮葡萄球菌內進行檢索，結果返回大量 相似序列者是不同表皮葡萄球菌菌株共有序列。結合兩種策略，最終得出DeoR family transcriptional regulator符合兩種策略標準，基因 Genbank登陸號為3240916,基因序 列如SEQ ID NO : 3所示。
[0025] 針對表皮葡萄球菌DeoR family transcriptional regulator基因，設計特異引 物：上游引物如SEQ ID NO: 1所示，下游引物如SEQ ID NO :2所示。表皮葡萄球菌特異引 物通過在線設計特異性寡核苷酸引物工具Primer-BLAST設計完成。設計步驟和注意事項 參照Primer-BLAST使用說明書進行。
[0026] 二、檢測方法的建立
[0027] DNA的提取，用北京莊盟國際生物基因科技有限公司的細菌基因組DNA小量提取 試劑盒進行抽提回收，步驟如下：
[0028] 1)取細菌培養液5mL，12, OOOrpm離心1分鐘，盡量吸凈上清。
[0029] 2)向留有菌體沉淀的離心管中加入500 μ L細胞懸浮液，使用移液器或渦旋振蕩 器徹底懸浮細菌細胞沉淀，37°C溫浴30分鐘。每隔10分鐘顛倒混勻數次。12, OOOrpm離心 2分鐘，盡量吸凈上清。
[0030] 3)向菌體沉淀中加入225 μ L緩沖液A，振蕩至菌體徹底懸浮。
[0031] 4)向管中加入6yL RNaseA溶液，振蕩15秒，室溫放置5分鐘。
[0032] 5)向管中加入10 μ L蛋白酶K溶液，顛倒混勻。
[0033] 6)加入25 μ L裂解緩沖液S，顛倒混勻。
[0034] 7)加入250 yL緩沖液Β，振蕩10秒，70°C放置10分鐘。12,000rpm離心1分鐘， 取上清放入一新管中，棄去沉淀。
[0035] 8)加入250 μ L無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉淀，瞬時離 心以去除管蓋內壁的水珠。
[0036] 9)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱中（吸附柱放入收集管中）， 12, OOOrpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中。
[0037] 10)向吸附柱中加入500 μ L緩沖液C，12, OOOrpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱 放入收集管中。
[0038] 11)向吸附柱中加入700 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm離心30秒，倒掉廢液，吸附柱放 入收集管中。
[0039] 12)向吸附柱中加入500 μ L漂洗液W2,12, OOOrpm離30秒，倒掉廢液，將吸附柱放 回收集管中。然后12, OOOrpm離心2分鐘。將吸附柱置于一個新的1.5mL離心管中，室溫 放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
[0040] 13)將吸附柱轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μ L洗 脫緩沖液ΤΕ，室溫放置2分鐘，12, OOOrpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0041] 三、PCR條件優化：
[0042] 1)對退火溫度和Mg2+同時進行優化。退火溫度為6個梯度，49、51、53、55、57、59 °C。 Mg2+濃度為5個梯度，0. 8、1. 6、2. 4、3. 2和4. OmM。所述通過聚合酶鏈式反應檢測表皮葡萄 球菌條件優化擴增體系為25 μ L。具體反應體系為：TaqDNA聚合酶0. 125 μ L，10 X聚合酶 緩沖液 2. 5 μ L，dNTP 2 μ L，Mg2+分別為 0. 8、I. 6、2. 4、3. 2 和 4. OmM，模板 1 μ L，上下游引物 各 I