Fam96ap基因及其表達產物的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種基因的應用，特別是涉及一種FAM96AP基因及其表達產物的應 用。
【背景技術】
[0002] 肝癌嚴重威脅著我國人民的生命健康。肝癌的診斷，尤其早期診斷是臨床診療和 預后的關鍵。目前，在我國肝癌的定性診斷仍以檢測血清AFP (甲胎蛋白）為主，呈現如下 特點：60%以上的肝癌病例血清AFP > 400 μ g/L ;目前還沒有其他腫瘤標志物的特異性可 與AFP相媲美；AFP檢測較少依賴影像學設備和新技術。AFP是目前全球應用最為廣泛的肝 癌腫瘤標志物，已經應用了數十年，其敏感性為40%~65%，特異性為76%~96%，如此的敏 感性和特異性均不令人滿意。因此，發現靈敏度和特異性高的新的腫瘤標志物將是提高肝 癌早期診斷水平的關鍵。除AFP外，近年來用于肝癌檢測的其他血清標志物還包括：甲胎 蛋白異質體、Y-谷氨酰轉肽酶同工酶II (GGT- II)、堿性磷酸酶同工酶I、醛縮酶同工酶A (ALD-A)、巖藻糖苷酶(AFU)、抗胰蛋白酶I、異常凝血酶原、鐵蛋白與酸性鐵蛋白等。AFP異 質體和異常凝血酶原的應用提高了肝癌患者的檢出率，但早期診斷和指導個性化治療的分 子分型診斷仍是我們面臨的極大挑戰。一般認為以下四類生物分子常作為原發性肝癌標志 物：①癌胚和糖蛋白抗原；②酶和同工酶；③細胞因子；④基因。
[0003] 然而，關于人FAM96AP基因在腫瘤的表達譜及與腫瘤發生的關系尚不清楚，有待 進一步研究。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種FAM96AP基因及其表達產物的應用，使肝癌 診斷更加準確、快速。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種FAM96AP基因及其表達產物在制備診斷 肝癌的產品中的應用。
[0006] 所述診斷肝癌的產品包括：用RT-PCR、實時定量PCR、免疫檢測、原位雜交或基因 芯片診斷肝癌的產品。
[0007] 在本發明中，所述用RT-PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增FAM96AP基因 的引物。
[0008] 所述用實時定量PCR診斷肝癌的產品至少包括一對特異擴增FAM96AP基因的引 物。其中，用于制備用RT-PCR或實時定量PCR診斷肝癌產品中的一對特異擴增FAM96AP基 因的引物，所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO. 1所示的序列或其互補序列，所述引 物對的下游引物序列具有如SEQ ID NO. 2所示的序列或其互補序列。
[0009] 所述用免疫檢測診斷肝癌的產品包括：與FAM96AP蛋白特異性結合的抗體，包括 多克隆抗體和單克隆抗體。
[0010] 所述用原位雜交診斷肝癌的產品包括：與FAM96AP基因的核酸序列雜交的探針。
[0011] 所述用基因芯片診斷肝癌的產品包括：與FAM96AP基因的核酸序列雜交的探針。
[0012] 在本發明中，可以使用一系列本領域已知的方法來制備針對FAM96AP蛋白特異的 抗體。例如，將提純的人FAM96AP基因產物或它的抗原片段注射入動物體內以產生多克隆 抗體。同樣，表達人FAM96AP蛋白或它的抗原的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。 根據本發明制備的抗體可以是單克隆抗體，這些單克隆抗體可用雜交瘤及時制備。本發明 的抗體包括可以阻抑FAM96AP功能的抗體，也可以是不影響人FAM96AP功能的抗體。每一 類抗體都可以通過對人FAM96AP基因產物的片段或功能域致免疫而產生，而人FAM96AP基 因產物及其片段可以用重組方法產生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的FAM96AP 基因產物結合的抗體，可以利用在原核細胞例如E. coli中產生的基因產物來免疫動物而 得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化FAM96AP蛋白或多肽結合的抗體，可以利用在 真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產生的基因產物來免疫動物而得到。
[0013] 在本發明中，所述探針可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其他衍生物。所述 探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可 以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至 60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信 號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿 基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15~25個堿基對最佳。所述探針自身互補最好少 于4個堿基對，以免影響雜交效率。
[0014] 本發明實驗證實FAM96AP基因在肝癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，因此， FAM96AP基因及其表達產物(蛋白產物）可作為診斷肝癌的特異性標志基因，使肝癌診斷更 加準確、快速。
【附圖說明】
[0015] 下面結合附圖與【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明：
[0016] 圖1是RT-PCR檢測FAM96AP基因在20例肝癌病人中癌旁組織及癌組織中的表達 情況，其中，N指癌旁組織，C指肝癌組織。
【具體實施方式】
[0017] 以下實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具 體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建 議的條件。
[0018] 實施例1RT-PCR實驗檢測FAM96AP基因在肝癌組織中的表達情況
[0019] RT-PCR 是指將逆轉錄（Reverse Transcription ;RT)反應和 PCR (Polymerase Chain Reaction)反應組合在一起的方法。RT-PCR將以RNA為模板的cDNA合成同PCR結合 在一起，提供了一種分析基因表達的快速靈敏的方法。RT-PCR用于對表達信息進行檢測或 定量。RT-PCR比其他包括Northern印跡、RNase保護分析、原位雜交及Sl核酸酶分析在內 的RNA分析技術，更靈敏，更易于操作。RT-PCR的模板可以為總RNA或poly (A)選擇性RNA。 逆轉錄反應可以使用逆轉錄酶，以隨機引物、oligo(dT)或基因特異性的引物起始。RT-PCR 可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中，每一步都在最佳條件下進行。cDNA 的合成首先在逆轉錄緩沖液中進行，然后取出1/10的反應產物進行PCR。
[0020] 1、組織分離
[0021] 實驗用組織來源于原發性肝癌的手術病人。手術切除的肝臟一經離體，迅速切取 病灶及周圍5公分外癌旁組織，放入液氮中（-80°C)保存。癌和癌旁的診斷均以病理診斷 為最終依據。
[0022] 2、總核糖核酸（RNA)的抽提試劑盒
[0023] 抽提總核糖核酸（RNA)采用TRIZOL (Invitrogen),該試劑是基于酸性酚一步抽提 法生產的。TRIZOL試劑是直接從細胞或組織中提取總RNA的試劑。它在破碎和溶解細胞時 能保持RNA的完整性。加入氯仿后離心，樣品分成水樣層和有機層。RNA存在于水樣層中。 收集上面的的水樣層后，RNA可以通過異丙醇沉淀來還原。用于抽提總核糖核酸（RNA)所用 的器皿和水均進行核糖核酸酶滅活處理，以保證實驗中無核糖核酸酶的環境。
[0024] 3、核糖核酸（RNA)抽提步驟
[0025] RNA提取的一般步驟是：破碎組織一分離RNA -沉淀RNA -洗滌RNA -融解RNA - 保存RNA。破碎組織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白 酶K等破碎組織，加入β-ΜΕ可以抑制RNA酶活性。分離RNA -半用酚、氯仿等有機溶劑， 加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA-般分布于上層，與蛋白層分開。沉淀RNA -般用乙 醇、3Μ NaAc (pH-5. 2)或異丙醇。洗滌RNA使用70%乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉， 此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。融解 RNA -般使用TE。保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的 樣品(如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存 更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中 提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的 降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲 酰胺中，存于_70°C。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的 RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA :加入 NaAc 至 0· 3M，12, 000X g 離心 5 分鐘。
[0026] 4、cDNA 的合成
[0027] (1)冰浴離心管里面加入模板RNA4 μ L(1 μ g/ μ L)，隨機引物2 μ L(20pmol/ μ L)， 去離子水5 μ L，混勻，離心3-5秒；
[0028] (2) 70°C水浴5分鐘，冰浴30秒(此處是為了使引物和模板正確配對）；
[0029] (3)加入5XM-MLV逆轉錄酶第一鏈緩沖液4 μ L(200U/ μ I)，RNase抑制劑 1 μ L (Ribonuclease Inhibitor，40U/ μ I，TaKaRa)，dNTP2 μ L (2. 5mM，TaKaRa)(這些應該先 配好，然后分再裝到每一管)，混勻；
[0030] (4) 37°C水浴5分鐘，加入1 μ L M-MLV RT反轉錄酶（200U/ μ 1)，混勻；
[0031] (5) 37°C水浴1小時(此步是反轉錄過程）；
[0032] (6) 70°C、10分鐘結束反應(此處是滅活酶活性，避免對后續實驗產生干擾)，產物 置冰上進行下一步PCR實驗，余下的-70°C保存。
[0033] 5、RT-PCR的引物設計及擴增
[0034] 理想的引物對只同目的序列兩側的單一序列而非其他序列退火。設計糟糕的引物 可能會同擴增其他的非目的序列。設計理想的引物都有以下共同的特點：典型的引物18到 24個核苷長。引物需要足夠長，保證序列獨特性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能 性。但是長度大于24核苷的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配 對序列雜交，降低了特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產量。選擇GC含量為40%到 60%或GC含量反映模板GC含量的引物。設計5'端和中間區為G或C的引物。這會增加 引物的穩定性和引物同目的序列雜交的穩定性。避免引物對3'末端存在互補序列，這會形 成引物二聚體，抑制擴增。避免3'末端富含GC。設計引物時保證在最