一種檢測口含煙制品對細胞早期凋亡影響的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種檢測口含煙制品對細胞早期凋亡影響的方法，屬于煙草及煙草制品安全性生物學評價技術領域。
【背景技術】
[0002]煙草監管立法的日趨嚴格以及吸煙與健康研宄的深入，導致了煙草公司尋求風險更低、無環境煙氣的新型煙草制品。國際煙草科學研宄合作中心CORESTA組織于2002年成立了卷煙煙氣體外毒理測試工作組，推薦了傳統卷煙的煙氣毒理學檢測方法。但是口含煙制品的使用方式與傳統卷煙吸入式不同，口含煙制品直接經口使用，且其溶出物會隨唾液進入消化系統，使用過程中不產生煙氣，其暴露途徑顯著有別于傳統卷煙，傳統卷煙的細胞毒性檢測方法可能不適用于口含煙。目前國內外研宄機構及煙草公司尚未制定統一的標準檢測方法用于口含煙制品的細胞毒性檢測。
[0003]對于卷煙細胞毒性的檢測，目前通常采用中性紅細胞毒性法，但存在一定的缺陷。中性紅進入細胞并在細胞內聚集的過程要求有完整的細胞膜，而細胞凋亡早期細胞膜表面發生改變，帶負電荷的磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。這種改變可能會影響中性紅細胞毒性法的檢測結果。細胞凋亡的概念是1972年由 Kerr 等三位科學家首次提出(Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR.Apoptosis: a basicb1logical phenomenon with wide-ranging implicat1ns in tissue kinetics.Br J ancer, 1972, 26:239 - 257.)，雖然細胞凋亡(apoptosis)與細胞壞死(necrosis)的最終結果極為相似，但它們的過程與表現卻有很大差別。細胞凋亡是一個主動過程，它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等的作用，它并不是病理條件下，自體損傷的一種現象，而是為更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡過程。因此，有必要開發一種用于檢測口含煙制品對細胞早期凋亡影響的方法，作為口含煙細胞毒性檢測的補充方法以區別制品對細胞壞死和凋亡的影響。
【發明內容】
[0004]本發明的目的正是針對上述技術問題，對口含煙制品細胞早期凋亡影響的流式檢測法進行了綜合研宄，確定了口含煙制品的檢測劑量，以及口含煙制品前處理方法，制定了一種適用于檢測口含煙制品對細胞早期凋亡影響的流式檢測法。
[0005]本發明通過下列技術方案實現:一種檢測口含煙制品對細胞早期凋亡影響的方法，經過下列各步驟:
(1)樣品前處理:
準確稱取1.0g 口含煙制品，加入30mL無血清培養基，于37°C下恒溫水浴中靜置24h后再進行萃取，萃取后先用定性濾紙進行初濾除渣處理，再用0.45 μ m有機濾膜過濾除菌，得到待測液；
(2)單細胞懸液的制備: 人口腔粘膜成纖維細胞hOMF細胞于37°C、5%C02、95%RH(空氣相對濕度)培養箱中培養，待細胞匯合率為80?90%時移除培養箱，再用磷酸緩沖液洗兩次，棄洗液，然后加入I?2mL濃度為0.25% (w/v)的胰蛋白酶溶液進行單層孵育I?2min，加入DMEM/F12細胞培養基懸起，形成單細胞懸浮液；
(3)單細胞懸浮液的細胞濃度計算:
用血球計數板計數法對步驟(2)所得單細胞懸浮液的細胞濃度進行計算，計算出每毫升單細胞懸浮液的活細胞數；
(4)細胞接種:
將步驟(3)計數后的單細胞懸浮液用DMEM/F12細胞培養基稀釋至1.0X 15個/mL，再按接種量為2mL/孔，接種到6孔細胞培養板中，將6孔細胞培養板置于37°C、5%C02培養箱內培養24h ；
(5)分組設定:分為細胞對照組和樣品組，其中細胞對照組加入DMEM/F12細胞培養基；樣品組加入不同劑量的步驟(I)所得待測液；
(6)劑量設定:
以樣品煙堿量作為檢測劑量劃分指標，設置4個非零劑量，即:20 μ g/mL、40 μ g/mL、60 μ g/mL、80 μ g/mL ；
(7)加入受試物:
移除步驟(4)中6孔細胞培養板內的培養基，再按步驟(5)進行分組，在對照組相應的孔內加入DMEM/F12細胞培養基；在樣品組相應的孔內加入步驟(I)所得待測液，使終濃度分別為步驟(6)設定的劑量；對照組和樣品組的終體積為2mL/孔；
(8)孵育受試物:
將步驟(7)加樣后的6孔細胞培養板置于37°C、5%C02、95%RH (空氣相對濕度)培養箱中孵育24h ；
(9)收集細胞:
收集步驟(8)中的培養液，貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化后連同收集的培養液，于300g的轉速下，4°C離心5min，收集細胞；
(10 )用預冷的PBS洗滌步驟(9 )所得細胞2次，每次均于300g轉速下，4°C離心5min，收集細胞，再加入100 μ L的Binding Buffer重懸細胞，加入5 μ L的Annexin V-FITC和5 μ L的PI染料，輕輕混勾，然后在避光、室溫下反應lOmin，再加入400 μ L的Binding Buffer進行混勻得到檢測樣品，在I小時內用流式細胞儀檢測，即得到細胞早期凋亡影響率。
[0006]本發明的優點在于:本發明對口含煙制品細胞早期凋亡影響的流式檢測法進行了綜合研宄，確定了口含煙制品的檢測劑量，以及口含煙制品前處理方法，制定了一種適用于檢測口含煙制品對細胞早期凋亡影響的流式檢測法，可作為口含煙細胞毒性檢測的補充方法以區別制品對細胞壞死和凋亡的影響。樣品的有效處理、檢測劑量的優化設定以及靶細胞的正確選擇，使得本方法能夠準確有效的檢測口含煙制品對細胞早期凋亡的影響。
【附圖說明】
[0007]圖1為駱駝(Camel)品牌薄荷口味Snus對細胞早期凋亡率影響的檢測結果。
【具體實施方式】
[0008]下面將結合具體實例對本發明做詳細描述，但并不限制本發明。
[0009]實施例1
用于駱駝(Camel)品牌薄荷口味Snus型口含煙制品對細胞早期凋亡率影響的檢測。
[0010](I)樣品前處理:
準確稱取1.0g 口含煙制品，加入30mL無血清培養基，于37°C下恒溫水浴中靜置24h后再進行萃取，萃取后先用定性濾紙進行初濾除渣處理，再用0.45 μ