一種酶法制備左旋多巴的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種制備左旋多巴的方法，特別涉及到一種酶法制備左旋多巴的方法，屬于微生物技術領域。
【背景技術】
[0002]左旋多巴(L-DOPA)，化學名稱為3，4_ 二羥基苯基丙氨酸，是L-酪氨酸到兒茶酚或黑色素的生化代謝途徑過程中的重要中間產物。L-DOPA的衍生物多巴胺是一種重要的神經遞質，由于多巴胺不能透過血腦屏障進入腦組織，所以不能通過補充多巴胺來治療帕金森氏病，而L-DOPA可以通過血腦屏障，并在腦組織中脫羧形成多巴胺，從而使腦組織中多巴胺含量增加而達到治療的目的。Birkmayer于1961年用左旋多巴治療獲得明顯療效。L-DOPA及復方左旋多巴(如美多芭)已成為治療常見老年病帕金森氏病的最有效的藥物。左旋多巴還可用來治療弱視、肝昏迷、心力衰竭等病癥；此外，人們還發現L-DOPA有抗衰老的功效。鑒于L-DOPA在醫藥衛生、保健美容等諸多領域的顯著功效，L-DOPA的生產很早就被人們所關注，預計未來幾年左旋多巴的全球銷售額會超過10億美元，市場容量巨大。
[0003]根據文獻報道左旋多巴的生產有天然植物提取法、化學合成法及微生物酶轉化法三種主要方法。
[0004]1、提取法
天然植物提取是從貓豆、藜豆等種子中提取，雖然貓豆等植物中存在的多巴都是左旋的，提取過程中免去了與手性異構體D-DOPA的拆分工藝，并且L-DOPA的提取得率也相應得到了一些提高，但由于受到原料來源少、產量小的限制，因而生產成本較高，難以大規模生產，遠不能滿足市場需求。
[0005]2、化學法
工業化生產左旋多巴多以香草醛和乙內酰脲為原料，經過8步的反應制得。盡管目前商品化左旋多巴主要通過不對稱法合成，但化學合成過程中需要大量的金屬催化物，并且過程繁雜，產物的轉化效率和旋光活性均較低，同時具有成本高、環境污染嚴重等問題。
[0006]3、酶轉化法 O酪氨酸酚解酶
酪氨酸酸解酶(tyrosine phenol lyase，TPL) (EC4.1.99.2)可催化苯酸、丙酮酸和氨水生成酪氨酸，該反應為可逆反應。若將苯酚置換成鄰苯二酚，該酶即可催化生成左旋多巴。Yanada等對Erwinia herbicola ATCC21434合成左旋多巴進行了深入的研宄，但前體物對酶反應有較強的抑制作用，甚至導致酶的不可逆失活，且產物和原料丙酮酸容易生產副產物，影響產率。
[0007]2)轉氨酶
轉氨酶(transaminase)可將L-天冬氨酸或L-谷氨酸中的氨基轉移到3，4-二輕基苯丙酮酸上，進而生成左旋多巴。Nagasaki等(Agriculture B1logy and Chemistry,1975，39:363-369.)研宄了 Enterobacter cloacae NB320，Alcaligenes faecalis 轉氛基作用生成左旋多巴的能力。然而由于轉氨作用存在諸多問題，隨后相關利用轉氨酶生成左旋多巴的研宄比較少見。
[0008]3)酪氨酸酶
酪氨酸酶(tyrosinase)可以酪氨酸直接作為底物，催化合成左旋多巴。1973年，日本的 Yoshida 等(Agriculture B1logy and Chemistry,1973,37:2121-2126.)用Vibr1 tyrosinaticus ATCC19378, 1989年武漢大學的彭珍榮等(氨基酸和生物資源，1996,4:1-4.)用假單胞菌屬細菌以酪氨酸為前體生產左旋多巴。彭珍榮的方法中酪氨酸酶的活性低，最高僅能將8.6g/L的酪氨酸轉化為7.8g/L的左旋多巴，再加入高含量的酪氨酸無法實現有效轉化，產物濃度較低，分離提取困難。日本的Yoshitake TanakaCAg1.B1l.Chem.38(3)，633-639，1974)還以誘變育種的方法提高了產酶性能，轉化后左旋多巴在轉化液中的濃度為21g/L，但是該方法酪氨酸摩爾轉化率不足70%，底物酪氨酸大量殘留，分離提取困難，距離工業應用具有相當的距離。
[0009]由此可以看出，目前公開的酪氨酸酶轉化酪氨酸制備左旋多巴的方法存在產量低或者轉化率低的問題，使產品收率低、分離提取困難，生產成本高，操作工藝較復雜，不利于產業化。
【發明內容】
[0010]針對現有技術中酪氨酸酶轉化酪氨酸制備左旋多巴方法存在的不足，本發明提供了一種酶法制備左旋多巴的方法，該方法酪氨酸轉化率高，左旋多巴濃度也高，具有工業化實用價值。
[0011]本發明可以通過以下技術方案實現:
一種酶法制備左旋多巴的方法，包括以下步驟:
(1)挑取一環嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonasmaltophilia )的菌種斜面，接入種子培養基中培養，得一級種子液；
(2)將一級種子液以3?10%的接種量接入發酵培養基中，進行發酵培養，發酵結束后離心，收集菌體細胞；
(3)在緩沖溶液中加入酪氨酸和菌體細胞，在18?30°C，pH5.0?6.0條件下進行酶促反應，將酪氨酸轉化為左旋多巴。
[0012]上述方法中，優選采用嗜麥芽假單胞菌(Pseudomonas maltophilia )ATCC17806作為產酪氨酸酶的菌種。
[0013]上述方法中，所用種子培養基由以下重量百分比的組分組成:葡萄糖1.2-2.0%，蛋白胨0.3-0.8%，氯化鈉0.3-0.8%，氯化銨0.1-0.5%，玉米漿0.8-1.2%，豆餅水解液0.5-1.5%，水余量，pH7.0o
[0014]上述方法中，所用發酵培養基由以下重量百分比的組分組成:葡萄糖1.5-2.5%,氯化銨0.5-1%，硫酸鎂0.02-0.05%，磷酸二氫鉀0.08-0.12%，氯化鈣0.008-0.012%，硫酸銅0.01-0.03%，玉米漿0.5-1.5%，豆餅水解液(又名豆濃)0.1-0.5%，水余量，ρΗ7.0。
[0015]上述方法中，種子培養基優選由以下重量百分比的組分組成:葡萄糖1.5%，蛋白胨0.5%，氯化鈉0.5%，氯化銨0.3%，玉米漿1%，豆餅水解液1%，水余量，ρΗ7.0。發酵培養基優選由以下重量百分比的組分組成:葡萄糖2%，氯化銨0.7%，硫酸鎂0.04%，磷酸二氫鉀0.1%，氯化鈣0.01%，硫酸銅0.02%，玉米漿1%，豆餅水解液0.3%，水余量，pH7.0。當采用優選的種子培養基和發酵培養基時，會提高左旋多巴的含量和酪氨酸的轉化率。
[0016]上述方法中，步驟(I)種子培養時，優選采用以下條件:28?32°C，150?200r/min培養24?26h。
[0017]上述方法中，步驟(2)發酵培養時，優選采用以下條件:攪拌轉速200?700r/min，溶氧20?50體積％，溫度28?30°C，培養36?38h。
[0018]上述方法中，步驟(2)中，發酵結束后將發酵液用冷凍離心機在0°C、8000r/min離心lOmin，收集菌體細胞。
[0019]上述方法中，步驟(3)中的緩沖溶液可以選自:乙酸-乙酸鹽緩沖溶液或Na2HPO4-NaH2PO4緩沖溶液。
[0020]上述方法中，每100ml緩沖溶液中加入10-25g的酪氨酸。采用優選菌種時，10-25g/L的酪氨酸的轉化率可達到90%以上，例如每100ml緩沖溶液中加入20_25g的酪氨酸時，酪氨酸的轉化率也能達到90%以上。
[0021]上述方法中，每100ml緩沖溶液中加入40_60g菌體細胞，用于轉化酪氨酸。
[0022]上述方法中，步驟(3)中，采用的表面活性劑為曲拉通XlOO或吐溫-80，還原保護劑為亞硫酸鈉或抗壞血酸。
[0023]步驟(3)中，表面活性劑在緩沖溶液中的濃度為0.01?0.3wt%,還原保護劑在緩沖溶液中的濃度為0.1?2wt%，硫酸銅在緩沖溶液中的濃度為0.01?0.lwt%。
[0024]上述步驟(3)中，酪氨酸可以一次性加入緩沖溶液中，也可以分多次加入緩沖溶液中。
[0025]進一步的，為了更好的提高酪氨酸的轉化率和左旋多巴的產量，在步驟(3)酶促反應將酪氨酸轉化為左旋多巴的過程中，本發明采用間歇弱通風的方式輔助酶促反應的進行，所述間歇弱通風的方式是指:反應過程中每小時通空氣15-20min，通氣量為0.1vvm?0.5vvm(vvm的意思是每分鐘通氣量與罐體實際料液體積的比值)。通過在酶促反應過