構建lqt疾病模型的方法及其在篩選藥物中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及構建LQT疾病模型的方法及其在篩選藥 物中的應用。
【背景技術】
[0002] 先天性長QT綜合征（long QT syndrome，LQTS)屬于遺傳性心律失常，是由于編碼 心肌細胞離子通道的基因異常所導致，也被稱為"離子通道病"。LQTS患者具有QT間期延 長（大于0. 48秒）和T波形態異常的心電圖特征，臨床表現為反復發作的暈厥和室性心律 失常，尤其是尖端扭轉性室性心動過速（Torsade de pointes, TdP)。據統計，未經治療的 LQTS患者的10年死亡率高達50%，且約1/2500的患者終身伴隨猝死風險。美國近年數據 顯示，LQTS在人群中的發病率約1:2000~1:5000,尤其多見于兒童和青少年。據此推算， 我國LQTS患者接近30萬。由于LQTS具有發病突然、猝死率高、青少年多發的特點，已成為 遺傳性心律失常的研宄前沿和熱點。目前認為先天性LQTS是由于調控心室肌細胞膜復極 化離子通道的基因發生突變所致。
[0003] 然而，目前關于LQTS疾病模型的研宄仍有待深入。
【發明內容】
[0004] 本發明旨在至少在一定程度上解決相關技術中的技術問題之一。為此，本發明的 一個目的在于提出一種具有能夠有效構建LQT疾病模型的方法。
[0005] 在本發明的第一方面，本發明提供了一種構建心肌細胞的方法，構建獲得的心肌 細胞可以作為LQT疾病模型。根據本發明的實施例，該方法包括：（1)利用附著體載體，將 重編程因子編碼基因引入攜帶LQTS相關突變基因的體細胞中，以便獲得誘導多能干細胞； 以及（2)在適于所述誘導多能干細胞分化的條件下，培養所述誘導多能干細胞，以便獲得 心肌細胞，所述心肌細胞構成所述LQTS疾病模型。發明人發現，利用本發明的該方法，能夠 快速有效地制備獲得LQTS疾病模型，且適于構建JLNS型LQT疾病S疾病模型，另外，本發 明的方法利用附著體載體方式進行重編程，避免了逆轉錄病毒引起的基因組不穩定性及潛 在的致癌性的風險，提高重編程效率。已知附著體質粒在作為載體將外源基因引入細胞中 時，不會整合到供體細胞基因組中，并且附著體質粒可以在后續細胞傳代過程中丟失，因此 可以得到無外源基因整合的重組細胞。但之前的很多嘗試利用附著體質粒作為載體將重編 程因子引入體細胞中來獲得誘導多能干細胞（iPSC)都未能成功，原因在于獲得誘導多能 干細胞需要同時轉入多個重編程因子，成功效率低。
[0006] 本發明的發明人通過采用經過優化的重編程因子的組合以及附著體質粒的分配， 可以成功地將重編程因子引入到來自LQT疾病患者的體細胞中。在本文中，所使用的術語 "重編程因子"是指一種或多種生物活性因子（例如生物活性因子混合物），其作用在細胞 上以改變轉錄，從而使細胞重編程為多潛能性（multipotency)或多能性（pluripotency) 細胞。可以向細胞提供重編程因子，所述細胞例如來自具有感興趣心臟病的家族史或遺傳 組成的個體的細胞，例如成纖維細胞、脂肪細胞、尿液細胞等，這些因子能夠單獨提供或以 重編程因子的單一組合物（即預先混合的組合物）來提供。可以相同的摩爾比或不同的摩 爾比來提供該因子。可以在培養本發明的細胞的過程中一次或多次提供該因子。根據本發 明的實施例，所述重編程因子包括：0CT4、S0X2、KLF4、NANOG、SV40LT、L-MYC和LIN28。由此， 有利于提高重編程效率。根據本發明的實施例，所述附著體載體包括：第一附著體質粒，所 述第一附著體質粒攜帶編碼0CT4的核苷酸序列、編碼S0X2的核苷酸序列、編碼KLF4的核 苷酸序列、編碼NANOG的核苷酸序列；第二附著體質粒，所述第二附著體質粒攜帶編碼0CT4 的核苷酸序列、編碼S0X2的核苷酸序列、編碼KLF4的核苷酸序列、編碼SV40LT的核苷酸序 列；以及第三附著體質粒，所述第三附著體質粒攜帶編碼L-MYC的核苷酸序列、編碼LIN28 的核苷酸序列。由此，能夠有效提高重編程效率，且第三附著體質粒攜帶編碼L-MYC的核苷 酸序列可以大大降低致癌風險。在本發明的實施例中，發明人還利用常規的逆轉錄病毒轉 染方法來獲得誘導多能干細胞，通過比較發現，通過采用上述附著體質粒組合，可以實現下 列優點的至少之一：
[0007] 1)安全，根據本發明的實施例，可以獲得無外源基因整合的iPSC，具有很大的細 胞治療方面的潛力；而逆轉錄病毒在重編程過程中會整合到細胞基因組中去，會對供體細 胞基因組造成一定的干擾，并有致癌風險。
[0008] 2)與傳統質粒相比，附著體質粒的表達時間較長，可以隨細胞的復制而復制，丟失 較慢，因此對于2-3周的重編程來講，可以起到穩定表達外源基因的作用。
[0009] 根據本發明的實施例，所述攜帶LQT相關突變基因的體細胞為來自LQT患者的尿 液細胞。由此，避免了從皮膚等部位取樣而對患者造成的疼痛和傷害。本發明的發明人驚 奇地發現利用本發明經過優化的重編程因子的組合以及附著體質粒的分配，可以成功地將 重編程因子引入到來自LQT疾病患者的尿液細胞中。
[0010] 根據本發明的實施例，所述LQT相關突變基因與SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列 (NCBI索取號：CCDS7736. 1)相比具有c. 605-2A>G/c. 815G>A的突變。換句話說，也就是SEQ ID NO: 1中第605位的A突變為G，第815位的G突變為A。
[0011] 根據本發明的實施例，步驟（1)進一步包括：（1-1)將所述附著體載體轉染所述攜 帶LQT相關突變基因的體細胞中，得到轉染后的體細胞；（1-2)于37°C、5% CO2條件下，利 用無滋養層人誘導多能干細胞（hiPSC)重編程培養基培養所述轉染后的體細胞；（1-3)在 轉染后的第15天將培養基換成mTeSRl繼續培養；（1-4)在轉染后的第25天，選取具有典 型人誘導多能干細胞形態的克隆進行純化擴增，以便獲得所述誘導多能干細胞。由此，能夠 快速有效地制備獲得誘導多能干細胞，且重編程效率高、致癌風險低、安全性高。另外，獲得 的誘導多能干細胞核型正常，高表達多能性標記物內源0ct4和內源Sox2, Nanog，Rexl，表 達量與人胚胎干細胞株H9相當。
[0012] 根據本發明的實施例，所述編碼0CT4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :2所示的 序列；所述編碼S0X2的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :3所示的序列；所述編碼NANOG的核 苷酸序列具有如SEQ ID NO :4所示的序列；所述編碼SV40LT的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :5所示的序列；所述編碼KLF4的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :6所示的序列；所述編碼 L-MYC的核苷酸序列具有如SEQ ID NO :7所示的序列；以及所述編碼LIN28的核苷酸序列 具有如SEQ ID NO :8所不的序列。由此，發明人發現可以進一步提尚重編程的效率。
[0013] 根據本發明的實施例，由誘導多能干細胞分化為心肌細胞的方法并不受特別限 制，發明人經過多次篩選實驗，發現，可以所述心肌細胞是通過下列步驟獲得的。具體的， 步驟⑵進一步包括：（2-1)利用分散酶對步驟⑴中所得到的所述誘導多能干細胞進行 分散，（2-2)按照2X10 5個細胞/10平方厘米，將所述多能干細胞接種在包被基質膠的含有 mTeSRl培養基的平板上，并培養至融合度為70~90%融合度；（2-3)在超慢貼附六孔板 中，使用ACCUTASE細胞消化液，將步驟（2-2)中所得到的培養物消化為單細胞，并在含有 Matrigel (40mg/mL)、BMP4 (Ing/mL ;Invitrogen)和 Rho 激酶抑制劑（ROCK) (IOmM ;R&D)的 mTeSRl培養基中5%氧氣條件下進行培養24小時；（2-4)將步驟（2-3)中所得的培養物 進行清洗，并更換為含有抗壞血酸（AA, 50mg/mL ;Sigma)、2mM Gluta-MAX-I (Invitrogen)、 BMP4(10ng/mL)和人重組激活素-A(10ng/mL ;Invitrogen)的 StemPro34SFM培養基中培養 三天；以及（2-5)向所得到的培養物中添加 Wnt抑制劑IWR-I (5mM;Enzo Life Sciences) 后繼續培養4天，以便獲得所述心肌細胞。由此可以顯著提高獲得心肌細胞的效率。
[0014] 在本發明的另一方面，本發明提供了一種心肌細胞。根據本發明的實施例，所述心 肌細胞是通過前面所述的方法構建的。
[0015] 在本發明的再一方面，本發明提供了前面所述的心肌細胞在篩選藥物中的用途， 所述藥物用于治療LQT疾病，優選JLNS型LQT疾病。發明人發現，本發明的心肌細胞保留 LQTS的基因型，心肌細胞表現出的特性與患者的臨床特征相吻合，通過使所述心肌細胞與 藥物接觸，能夠有效篩選用于治療LQT疾病，特別是JLNS型LQT疾病的藥物。具體的，根據 本發明的實施例，將候選化合物與根據本發明實施例的心肌細胞接觸，并且檢測與候選化 合物前后，心肌細胞的動作電位時程的延長，如果接觸后動作電位時程明顯的延長得到明 顯改善，則說明該候選化合物可以用于治療LQT疾病。利用該方法，發明人驗證了目前所使 用的exiletine滿足上述篩選要求。
[0016] 在本發明的又一方面，本發明提供了一種制備誘導多能干細胞的方法。根據本發 明的實施例，該方法包括：（1)利用附著體載體，將重編程因子編碼基因引入體細胞；以及 (2)在適于體細胞重編程的條件下，對步驟（1)中得到的細胞進行培養，以便獲得誘導多能 干細胞。發明人發現，利用本發明的該方法能夠快速有效地