一種核苷酸序列及其在提高菌株耐酸性中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種核苷酸序列及其在提高菌株耐酸性中的應用。
【背景技術】
[0002]細胞對酸脅迫的抗性差是傳統發酵工業節能減排的關鍵共性問題。有機酸、氨基酸產業作為我國發酵產業的重要組成部分，其目的產物導致了不利于細胞生長與維持正常代謝活性的酸性微環境，并嚴重影響了生產條件穩定性的維持。迄今為止，絕大多數工業微生物的耐酸研宄都集中在大規模的誘變和篩選，研宄周期長、工作量大，且屬于暗箱操作，不能根據目標表型獲得相應的基因型，即不清楚突變發生的位置和機理。因此，研宄微生物酸耐受性機制，提高微生物對酸耐受性十分重要。目前研宄表明，工業微生物的耐酸機制同時涉及有機酸的跨膜運輸、體內協同轉運、以及與能量因子偶聯等多種作用形式，是個復雜的科學問題。
[0003]大腸桿菌基因組共含有4000多個基因，這些基因的轉錄特異性受到兩步調控:第一步就是RNA聚合酶σ因子的轉錄識別，第二步是約240-260個其他特異性轉錄因子的識另O。在大腸桿菌的不同生長環境中，其RNA聚合酶是通過轉錄特異基因的選擇性σ因子改變基因組的轉錄來調控整個生長過程。目前大腸桿菌中發現的σ因子有7種，分別為:oD(O 7°)、σΝ ( O 54)、Os ( O 38)、σΗ ( O 32)、Of ( O 28)、O E ( O 24)和。fecI。其中，O D 是最主要的σ因子，負責與細胞生長相關的1000多個基因的轉錄控制，是提高大腸桿菌耐酸性的最佳對象。
[0004]隨機片段交換法是一種新的突變文庫構建方法，它匯集了多種DNA序列的突變形式，各種形式可以單獨發生，也可以同時發生。2006年，Fujii等利用此方法對TEM-1型β -內酰胺酶進行進化，經過三輪突變，使其對頭孢他啶(ceftazidime)的最小抑制濃度提高了 5000倍。因此，將隨機片段交換法替代易錯PCR構建基因突變文庫方法，不僅可以簡化實驗操作步驟，同時又能增強突變文庫的多樣性，將大大提高工業微生物耐酸表型定向篩選的效率。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是通過突變全局轉錄調控因子σ D，篩選得到能夠提高大腸桿菌耐酸性的突變菌株，并獲得該轉錄調控因子的多核苷酸序列。
[0006]為了達到本發明的技術目的，發明人以攜帶基因(gene ID 947567)完整序列(含上游天然啟動子區域和下游終止子區域)的大腸桿菌疋coli DH5 alpha基因組為模板，構建基因的突變文庫。將以隨機片段交換法獲得的突變基因為目的片段，以低拷貝表達質粒PKSC為載體，通過T4DNA連接酶連接，得到帶有rpoD突變基因的重組質粒，經熱激法轉化E.coli DH5 alpha感受態細胞，涂布含有30 μ g/mL卡那霉素的LB平板，37°C培養過夜。洗脫單菌落，利用平板試管交替篩選的模式，最后篩選得到顯著提高大腸桿菌酸耐酸性的trpdd。
[0007]在本發明中的大腸桿菌基因工程菌中的oD突變基因ir/7oD攜帶個突變位點，分別為 Pro60Ser, Thr95Ile, Phe221Leu, Ile249Phe, Ile287Val, Ile511Val,His518Leu, Glu538Val, Ala542Val, Asp566Asn, Glu605Gly, Leu607Gln，其中，堿基序列1-194位為天然啟動子區域，2051-2075位為終止密碼子區域；攜帶該sigma D突變基因trpo\)的大腸桿菌E.coli DH5 alpha無需添加IPTG誘導表達，且能耐低pH，而普通大腸桿菌在低pH條件下就停止生長。
[0008]基于此，本發明提供的技術方案包括:
一種多核苷酸，包含由SEQ ID NO:1代表的核苷酸序列，或由SEQ ID NO:1代表的核苷酸序列中第I至1842位的核苷酸殘基組成的核苷酸序列。
[0009]來源于大腸桿菌的如權I所述的多核甘酸。
[0010]一種蛋白質，包含由SEQ ID NO:2代表的全長氨基酸序列，或由SEQ ID NO:2代表的全長氨基酸序列中第I至614位氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
[0011]本發明所述的蛋白質其含有，Pro60Ser,Thr95Ile, Phe221Leu, Ile249Phe,Ile287Val, Ile511Val, His518Leu, Glu538Val, Ala542Val, Asp566Asn, Glu605Gly,Leu607Gln，12個突變位點。
[0012]含有如權利要求1所述多核苷酸序列，或如權利要求2或3所述蛋白質的多核苷酸序列表達載體。
[0013]含有如權利要求5所述表達載體的菌株；該菌株優選為大腸桿菌。
[0014]本發明所述的多核苷酸在提高菌株耐酸性中的應用。
[0015]構建耐酸性菌株的方法，包含如下步驟:
(1)以攜帶基因完整序列的大腸桿菌疋coliDH5 alpha基因組為模板進行隨機突變，獲得突變基因；
(2)以突變基因為目的片段，以低拷貝質粒pKSC為表達載體，構建oD基因突變庫；
(3)將載體轉入大腸桿菌，并進行高通量篩選，以低pH為篩選壓力，進行液體和瓊脂平板交替篩選。
[0016]通過本發明的技術方案，可以帶來以下有益技術效果:
(I)通過對全局轉錄調控因子σ D連續突變，顯著提高了大腸桿菌對低pH的耐受性，為解決大腸桿菌等工業微生物細胞對酸脅迫響應調控過程提供了方法，使人們能更有效地控制和設計微生物細胞抗逆元器件，有助于提高工業微生物的應用效益。
[0017](2)提供了新的抗酸性多核苷酸序列，該序列可用于提高工業微生物的耐酸性。
【附圖說明】
[0018]圖1攜帶sigma D突變基因trpd)的質粒pKSC電泳圖。
[0019]圖2 大腸桿菌疋 coli DH5 alpha-pKSC- trpd)和大腸桿菌疋 coli DH5alpha-pKSC-/77oD 在 pH4.0 時的耐酸情況。
[0020]圖3 大腸桿菌萬.coli DH5 alpha-pKSC- trpd)和大腸桿菌萬.coli DH5alpha-pKSC-/77oD 在 ρΗ3.5 時的耐酸情況。
【具體實施方式】
[0021]下面結合實施例對本發明做進一步說明。所列的實施例僅作闡示
實施例1本實施例說明利用隨機片段交換法定向突變出發菌株大腸桿菌疋COliDH5 alpha中編碼sigma D的基因rpoD，并構建σ D突變基因文庫的方法。
[0022](I)利用LB培養基，于37°C，有氧條件下過夜活化大腸桿菌E.coli DH5 alpha，利用Takara細菌基因組抽提試劑盒提取基因組。
[0023](2)以大腸桿菌疋co7i DH5 alpha基因組為模板，PCR擴增rpoD基因片段，所用引物，單下劃線同源片段:
rpdd-￥\ CCGAATTCTGATTTAACGGCTTAAGTGCCGAAG ；rpdd-R: TACGGCTTGCCGGGTGCGGCGTAAC。
[0024]PCR 反應條件:94°C變性 4 min，