一種編碼IER5基因的shRNA序列的DNA序列及其載體和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥基因工程領域，具體而言，一種編碼IER5基因的ShRNA序列的DNA 序列及其載體和應用。
【背景技術】
[0002] 小干擾 RNA(short/small interferencing RNA, siRNA)能引發機體組織細胞功 能的變化，一個分子可以誘發數十甚至數百個革EmRNA個體分子的降解[Tononi G, Cirelli C. Modulation of brain gene expression during sleep and wakefulness: a review of recent findings [J]· Neuropsychopharmacology 2001, 25 (5Suppl):S28_35·]。小發卡或 短發卡RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA)是一段具有緊密發卡環 的RNA序列，常被用于RNA干擾沉默靶基因的表達。利用載體把shRNA導入細胞，載體中 的U6啟動子確保shRNA總是表達；這種裝載了 shRNA載體可被傳遞到子代細胞中去，從而 使基因的沉默可被遺傳。shRNA的發卡結構可被細胞機制切割成siRNA，然后siRNA結合到 RNA誘導沉默復合物上（RNA-induced silencing complex，RISC)，該復合物能夠結合到目 的mRNAs并將其降解。作為一種成熟的分子生物學技術，主要是使特定基因功能喪失從而 確定該基因的功能，其原理是將外源性雙鏈RNA(double strain RNA，dsRNA)導入生物體的 細胞中，使得與dsRNA同源的mRNA在翻譯之前即快速降解，從而其相應的靶基因表達受到 抑制。RNA干擾的基本過程是將外源性基因（病毒基因、人工轉入基因、轉座子等）隨機整 合到宿主細胞基因組內，利用宿主細胞進行轉錄，產生與外源基因互補的dsRNA，隨后被類 似于核糖核酸酶ΠΙ的Dicer酶切割成短的21~23nt的雙鏈siRNA。siRNA被解鏈為正 義鏈和反義鏈后，其中反義鏈與核酸內外切酶、解旋酶和其他因子結合，共同構成RNA誘導 沉默復合物（RNA-induced silencing complex, RISC)。激活的RISC通過堿基配對定位到 同源mRNA轉錄本上，在距離siRNA 3'端12個堿基的位置切割mRNA，使轉錄的基因表達終 止。每個RISC都包含一個siRNA和一個不同于Dicer的RNA酶，因此，siRNA的反義鏈作 為引物，以宿主細胞中序列同源互補的mRNA為靶點，在RNA依賴的RNA聚合酶的作用下形 成新的dsRNA，重復上述過程從而形成大量的siRNA，通過促使特定基因的mRNA降解，在短 時間內來高效、特異地抑制mRNA翻譯形成蛋白質或多肽，從而阻斷體內特定基因表達，誘 發細胞呈現出特定基因表達降低表型。RNA干擾技術以特異性強、效率高等特點被廣泛應用 于基因沉默領域，由于其可以阻斷或抑制特定基因表達，從而成為基因治療的新手段。
[0003] 基因治療作為治療惡性腫瘤的一大熱門研宄領域，細胞、組織的生物學功能是由 基因調控的，國內外多位學者通過基因芯片技術等發現多種組織細胞經輻射后，其IER5 基因的轉錄或翻譯成倍增加 [Kis E, Szatm ? ri T, S ? fr ? ny G，et al. Microarray analysis of radiation response genes in primary human fibroblasts[J]. Int J Radiat Oncol Biol Phys.2006Dec I ;66 (5):1506-14.],可見該基因與細胞輻射后的生 物學改變密切相關。IER5基因是早期反應家族中的一員，人IER5基因在美國國立生物 技術信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI)基因庫中編 號為NM_016545. 4,全長2350bp，主要參與對外界刺激的快速應答及細胞周期的調節等 [Williams M, Lyu MS, Hunter K, et al. Ier5, a novel member of the slow-kinetics Immediate-Early Genes [J]· Genomics, 1999 Febl ;55(3) :327-34.]。如何通過該基因與放 射生物學效應的關系，并摸清它是通過哪些信號傳導途徑發揮作用，從而引起腫瘤細胞凋 亡，把宮頸癌的放射治療提升到一個新的層次。
[0004] 申請號為200810057735. 2公開了編碼IER5的siRNA的DNA序列及其載體，但其 使用的質粒載體較舊，重復性差。
[0005] 有鑒于此，特提出本發明。
【發明內容】
[0006] 本發明的第一目的在于提供一種編碼IER5基因的ShRNA序列的DNA序列，所述的 DNA序列插入載體穩定，沉默IER5基因效果好。
[0007] 本發明的第二目的在于提供一種含有所述DNA序列的載體。
[0008] 本發明的第三目的在于提供DNA序列及其含有該序列的載體在制備治療宮頸癌 藥物中的應用。
[0009] 為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：
[0010] 一種編碼IER5基因的ShRNA序列的DNA序列，所述DNA序列以如SEQ ID NO. 1所 示的正義鏈和如SEQ ID NO. 2所示的反義鏈設計得到。
[0011] 一種編碼IER5基因的shRNA序列的DNA序列，所述DNA序列以如SEQ ID NO. 3所 示的正義鏈和如SEQ ID NO. 4所示的反義鏈設計得到。
[0012] 本發明提供的編碼IER5基因的shRNA序列的DNA序列，是在IER5基因全序列的基 因編碼區（Coding Sequence，Q)S)中尋找革巴序列，利用在線siRNA設計軟件（WhiteHead)， 參考小干擾RNA設計原則，進行初步設計挑選，從眾多序列中篩選得到的兩對靶序列，由這 兩對靶序列設計的編碼IER5基因的shRNA序列的DNA序列插入載體穩定，沉默IER5基因 效果好。
[0013] 其中，上述靶序列，根據以下原則設計：
[0014] ① GC 含量在 30-52 % ;
[0015] ②第19個堿基不能為G或C ;
[0016] ③正義鏈5'端第1-4個堿基GC多，第15-19個堿基GC少；
[0017] ④第1個堿基為G或C ;
[0018] ⑤第3個堿基為A，第10個堿基為U，第13個堿基不能為G，第16個堿基為C ;
[0019] ⑥3'端以UU結尾。
[0020] 優選地，所述正義鏈與所述反義鏈之間的莖環序列如SEQ ID NO. 5所示。得到的 DNA序列導入細胞中，編碼的shRNA序列被細胞機制切割成siRNA，然后siRNA結合到RNA 誘導沉默復合物上（RISC)，該復合物結合到目的mRNAs，使mRNA迅速、高效降解。
[0021] 為了將編碼IER5基因的shRNA序列的DNA序列與載體連接，以導入細胞發揮作 用，優選地，所述DNA序列的一端添加有BamHl酶切位點，另一端添加有HindIII酶切位點。
[0022] 優選地，所述DNA序列的正義鏈如SEQ ID NO. 6所示，反義鏈如SEQ ID NO. 7所示。 該DNA序列根據SEQ ID NO. 1所示的正義鏈和如SEQ ID NO. 2所示的反義鏈設計得到。
[0023] 優選地，所述DNA序列的正義鏈如SEQ ID NO. 8所示，反義鏈如SEQ ID NO. 9所示。 該DNA序列根據SEQ ID NO. 3所示的正義鏈和如SEQ ID NO. 4所示的反義鏈設計得到。
[0024] 經過篩選，得到兩對DNA序列，其中一對如SEQ ID NO. 6和SEQ ID NO. 7所示，另 一對如SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示，這兩對DNA序列經多方面驗證具有更好的沉默 效果。
[0025] 本發明還提供了含有所述的DNA序列的載體。
[0026] 優選地，構建所述載體的質粒為pSilencer4. 1-CMV。
[0027] 本發明還提供了所述的DNA序列在制備治療宮頸癌藥物中的應用。
[0028] 本發明還提供了所述的載體在制備治療宮頸癌藥物中的應用。
[0029] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0030] (1)本發明提供了兩對能有效抑制IER5基因的表達的DNA序列；
[0031] (2)本發明構建了能穩定表達含有編碼IER5基因的shRNA序列的DNA序列的載 體；
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