抑制腫瘤生長的重組間充質干細胞及其制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學和醫學領域，具體涉及一種抑制腫瘤生長的重組間充質干 細胞及其制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs)存在于幾乎所有的組織中，并且 已從肌肉、骨髓、脂肪組織、牙髓、臍帶、胎盤和羊膜液中分離出。MSCs被認為是具有強大 的自我更新能力和多向分化潛能的非造血干細胞，在再生醫學中具有極其重要的治療學意 義。根據不同的用途可以特異性的將MSCs向不同的亞型轉化，更精確的發揮MSC的功能。
[0003] TNF α 誘導蛋白 3 (tumor necrosis factor a induced protein 3, TNFAIP3, A20) 被認為是重要的抗炎和免疫調控蛋白。大多數細胞中A20都是低表達的，當NF- κ B被TNF α 等炎性因子活化后，會與Α20啟動子區的NF-κ B受體結合，Α20會迅速被活化并且負調控 NF-κB、MAPK等通路，從而改變IFNγ、TNFα、IL-12、IL10、IL-15和IL-21在內的多種細 胞因子的表達水平。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種抑制腫瘤生長的重組間充質干細胞及其制備方法與應 用。
[0005] 本發明提供的重組間充質干細胞，是降低受體間充質干細胞中Α20基因表達量 得到的重組間充質干細胞；所述受體間充質干細胞為離體的間充質干細胞；所述Α20基因 是TNFa誘導蛋白3。所述降低受體間充質干細胞中Α20基因表達量是通過向所述受體間 充質干細胞中導入抑制所述受體間充質干細胞中Α20基因表達的物質實現的。所述Α20基 因為編碼序列表的序列3所示的蛋白質的基因。所述Α20基因為包括序列表的序列4自 5'末端第78-2516位核苷酸所不DNA分子的DNA分子。所述Α20基因具體可為序列表的 序列4所不的DNA分子或序列表的序列4自5'末端第78-2516位核苷酸所不的DNA分子。 所述抑制所述受體間充質干細胞中Α20基因表達的物質可為任何可以降低所述受體間充 質干細胞中Α20基因表達的shRNA、編碼所述shRNA的DNA分子、表達所述shRNA的表達載 體、表達所述shRNA的重組微生物（如病毒）；抑制所述受體間充質干細胞中A20基因表達 的物質還可為降低所述受體間充質干細胞中A20基因表達的siRNA、編碼所述siRNA的DNA 分子、表達所述siRNA的表達載體、表達所述SiRNA的重組微生物（如病毒）。所述抑制所 述受體間充質干細胞中A20基因表達的物質具體可為序列表的序列1所示的shRNA。所述 抑制所述受體間充質干細胞中A20基因表達的物質具體可為將序列1所示的shRNA的編碼 DNA (將SEQ ID No. 1的核苷酸U替換為T的雙鏈DNA)插入慢病毒載體GVl 12的多克隆位 點（如Hpa I和Xho I位點間）得到的重組質粒。所述受體間充質干細胞為小鼠骨髓原代 MSCs或小鼠胚胎間充質干細胞系C3H/10T1/2。
[0006] 本發明還保護制備所述重組間充質干細胞的方法，包括如下步驟：降低受體間充 質干細胞中A20基因表達量，得到所述重組間充質干細胞；所述受體間充質干細胞為離體 的間充質干細胞；所述A20基因是TNFa誘導蛋白3。所述降低受體間充質干細胞中A20基 因表達量是通過向所述受體間充質干細胞中導入抑制所述受體間充質干細胞中A20基因 表達的物質實現的。所述A20基因為編碼序列表的序列3所不的蛋白質的基因。所述A20 基因為包括序列表的序列4自5'末端第78-2516位核苷酸所示DNA分子的DNA分子。所述 A20基因具體可為序列表的序列4所示的DNA分子或序列表的序列4自5'末端第78-2516 位核苷酸所示的DNA分子。所述抑制所述受體間充質干細胞中A20基因表達的物質可為 任何可以降低所述受體間充質干細胞中A20基因表達的shRNA、編碼所述shRNA的DNA分 子、表達所述shRNA的表達載體、表達所述shRNA的重組微生物（如病毒）；抑制所述受體 間充質干細胞中A20基因表達的物質還可為降低所述受體間充質干細胞中A20基因表達的 siRNA、編碼所述siRNA的DNA分子、表達所述siRNA的表達載體、表達所述siRNA的重組微 生物（如病毒）。所述抑制所述受體間充質干細胞中A20基因表達的物質為序列表的序列 1所示的shRNA。所述抑制所述受體間充質干細胞中A20基因表達的物質具體可為將序列 1所示的shRNA的編碼DNA (將SEQ ID No. 1的核苷酸U替換為T的雙鏈DNA)插入慢病毒 載體GV112的多克隆位點（如Hpa I和Xho I位點間）得到的重組質粒。所述受體間充質 干細胞為小鼠骨髓原代MSCs或小鼠胚胎間充質干細胞系C3H/10T1/2。
[0007] 本發明還保護所述重組間充質干細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。所述腫瘤為黑 色素瘤。具體可為B16-R)細胞引起的黑色素瘤。
[0008] 本發明還保護一種抗腫瘤藥物，其活性成分為所述重組間充質干細胞。所述腫瘤 為黑色素瘤。具體可為B16-R)細胞引起的黑色素瘤。
[0009] 本發明還保護下述1)-10)中的任一種抑制受體間充質干細胞中A20基因表達的 生物材料：
[0010] 1)序列表的序列1所示的ShRNA ;
[0011] 2)表達1)所述的shRNA的表達載體；
[0012] 3)表達1)所述的shRNA的重組微生物細胞；
[0013] 4)表達1)所述的shRNA的重組動物細胞；
[0014] 5)表達1)所述的shRNA的重組植物細胞；
[0015] 6) 1)所述 shRNA 產生的 siRNA ;
[0016] 7)表達6)所述siRNA的表達載體；
[0017] 8)表達6)所述siRNA的重組微生物細胞；
[0018] 9)表達6)所述siRNA的重組動物細胞；
[0019] 10)表達6)所述siRNA的重組植物細胞。
[0020] 本發明對于腫瘤的治療，特別是對于黑色素瘤的治療具有重大價值。
【附圖說明】
[0021] 圖1為實施例1中，不同濃度的炎癥細胞因子誘導MSCs中的A20基因表達一定時 間的結果。
[0022] 圖2為實施例1中，固定濃度的炎癥細胞因子誘導MSCs中的A20基因表達不同時 間的結果。
[0023] 圖3為實施例3中，shA20 MSCs和shCTRL MSCs的形態比較、A20基因 mRNA的表 達水平比較和免疫表型比較。
[0024] 圖4為實施例3中，shA20 MSCs和shCTRL MSCs的增殖特性與周期特性比較。
[0025] 圖5為實施例3中，shA20 MSCs和shCTRL MSCs的分化性能比較。
[0026] 圖6為實施例4中，shA20減弱MSCs的免疫抑制作用。
[0027] 圖7為實施例5中，shA20 MSCs對腫瘤的抑制作用。
[0028] 圖8為實施例6中，機理分析的結果（實時定量PCR)。
[0029] 圖9為實施例6中，機理分析的結果（western blot)。
【具體實施方式】
[0030] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0031] a -MEM 培養液：Gibco 公司，CAT. NO. 12000-022。DMEM-HG 培養液：Gibco 公司， CAT. NO. 10566-024。胎牛血清：上海依科賽生物制品有限公司，CAT. NO. FSP500。0.01M、 pH7. 2-7. 4的PBS緩沖液：Sigma公司。地塞米松、磷酸化維生素 C、β -磷酸甘油、II型膠原 酶、胰酶、油紅0染液和堿性磷酸酶試劑盒均為Sigma公司產品。慢病毒載體GV112 :上海 吉凱基因化學技術有限公司。B16-R)細胞（小鼠黑色素瘤細胞）：中國醫學科學院基礎醫 學研宄所基礎醫學細胞中心，貨號為3111C0001CCC000215。
[0032] C57BL/6小鼠：購自軍事醫學科學院實驗動物中心；在無特定病原體條件下飼養， 動物在年齡和性別上都相互匹配，并且所有的實驗操作都符合軍事醫學科學院實驗動物條 例。
[0033] 小鼠骨髓原代MSCs (即來源于C57BL/6小鼠的骨髓的原代MSCs)的分離和培 養按照下述文獻中的方法進行：丫&叩，￥.1\1，1^，!1.，211&叩，1^，0&叩，1?.]\，1^，？.，聽1叩，父· Υ. , Zhu, Η. , Guo, X. Μ. , Zhang, Y. , Liu, Y. L. , et al. (2013). [A new method for isolating and culturing mouse bone marrow mesenchymal stem cells]. Zhongguo shi yan xue ye xue za zhi/Zhongguo bing Ii sheng Ii xue hui = Journal of experimental hematology/Chinese Association of Pathophysiology 21, 1563-1567。
[0034] 小鼠胚胎間充質干細胞系C3H/10T1/2 (簡稱C3H/10T1/2細胞）：ATCC，CCL-226?; 生長在含有4mM谷氨酰胺、lOOU/ml青霉素、lOOU/ml鏈霉素和10% (體積百分含量）胎牛 血清的α-ΜΕΜ培養液中，在5% C02、37°C條件下培養。
[0035] 采用FACS檢測細胞的免疫表型，數據在FACS Aria II (BD)上收集并且用FlowJo 軟件（TreeStar)分析。抗小鼠⑶45抗體、抗小鼠⑶105抗體、抗小鼠⑶44抗體、抗小鼠⑶29 抗體、抗小鼠 CDllb抗體、抗小鼠 CD31抗體和抗小鼠 Sca-I (Seal)抗體均屬于BioLegend. BrdU 流式