一種全層皮膚模型的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于組織工程學(xué)醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種可替代皮膚進(jìn)行化妝品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、一次性衛(wèi)生用品等產(chǎn)品的安全性與功效檢測(cè)及其他與皮膚接觸的材料的安全性與功效性評(píng)價(jià)的全層皮膚模型的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]皮膚模型是指利用工程學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的原理和方法，在體外人工制備的皮膚替代品。全層皮膚模型與正常皮膚結(jié)構(gòu)高度類似，具有完整的表皮層和真皮層結(jié)構(gòu)，除可用來修復(fù)、替代缺損的皮膚組織外，其最大的用途在于替代人體皮膚組織進(jìn)行化妝品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、一次性衛(wèi)生用品、與皮膚接觸材料的安全性與功效性評(píng)價(jià)。
[0003]真皮層的體外構(gòu)建技術(shù)是全層皮膚模型開發(fā)的關(guān)鍵。目前，主要有兩種類型的技術(shù):一種是應(yīng)用材料學(xué)和生物工程學(xué)原理構(gòu)建的真皮替代物，該類體外構(gòu)建技術(shù)不利于細(xì)胞生長(zhǎng)，難以實(shí)現(xiàn)替代真皮組織進(jìn)行細(xì)胞功能的檢測(cè)與評(píng)價(jià)。另一類是應(yīng)用細(xì)胞復(fù)合材料培養(yǎng)的方法，比如以膠原等天然材料為支架，復(fù)合成纖維細(xì)胞構(gòu)建成真皮層，并于其上接種表皮細(xì)胞，進(jìn)一步構(gòu)建成全層皮膚結(jié)構(gòu)(如專利CN101062429、CN103041453A)。但此法獲得的人工皮膚無法完全替代皮膚組織進(jìn)行化妝品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、皮膚接觸性材料等的測(cè)試評(píng)價(jià)要求。用支架材料和活細(xì)胞構(gòu)建的皮膚模型在培養(yǎng)過程中伴隨著活細(xì)胞自身膠原的分泌以及支架材料的降解，導(dǎo)致人工皮膚組織收縮現(xiàn)象，嚴(yán)重影響全層皮膚模型體外構(gòu)建中的傳質(zhì)效率，造成邊緣收縮與培養(yǎng)器皿壁的分離，同時(shí)真表皮層之間不能形成與天然皮膚一致的基底膜結(jié)構(gòu)，均對(duì)體外測(cè)試結(jié)果有影響。
[0004]目前尚未有不采用支架材料，僅依靠細(xì)胞自身分泌的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)建形成的真皮層結(jié)構(gòu)以及由真皮層支持生發(fā)的表皮結(jié)構(gòu)結(jié)合形成的全層皮膚結(jié)構(gòu)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是:構(gòu)建一種全層皮膚模型，該皮膚模型不含外源支架材料，具有成纖維細(xì)胞及自分泌細(xì)胞外基質(zhì)組成的真皮層和表皮細(xì)胞組成的表皮層，結(jié)構(gòu)更接近人體皮膚結(jié)構(gòu)，具有良好的力學(xué)性能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和細(xì)胞應(yīng)答敏感性等特點(diǎn)，可應(yīng)用于多種皮膚替代測(cè)試。
[0006]本發(fā)明的全層皮膚模型的體外構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0007]步驟一、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)
[0008]成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng):將已去除脂肪和結(jié)締組織的Imm3的皮膚組織，置于含有膠原酶200U.πιΓ1、透明質(zhì)酸300U.πιΓ1的培養(yǎng)液I中，放置4°C過夜；再加入等體積的消化液，37°C空氣搖床180rpm 20min后終止消化；100rpm離心1min收集細(xì)胞；用培養(yǎng)液II調(diào)整細(xì)胞密度，每毫升2 X 15?4X 10 5個(gè)/cm 2細(xì)胞接種，5% CO 2、37°C條件下培養(yǎng)；
[0009]表皮細(xì)胞分離培養(yǎng):將表皮組織浸沒于1.2U/mL的消化液中，置入4°C條件下16?20h ;在無菌條件下撕下表皮層，將表皮層放入37°C預(yù)熱的消化液中，維持37°C消化1min后終止:每2min震蕩3下；無菌200目篩網(wǎng)過濾，800r/min離心6min后棄上清；加入37°C預(yù)熱的PBS緩沖液，吹打至均勻后，再次800r/min離心6min后，棄上清:加入培養(yǎng)液I，吹打至均勻；按照3 X 14?5X10 4個(gè)/cm2的密度接種，移入5% CO 2、37°C條件下培養(yǎng)，取第3?7代細(xì)胞用于構(gòu)建。
[0010]其中培養(yǎng)液I為DMEM (sigma公司生產(chǎn))，含有谷氨酰胺2?10mM、孕酮10?20nM、丁二胺30?60 μΜ、砸酸鈉15?30ηΜ、轉(zhuǎn)鐵蛋白65?100ng/ml ;培養(yǎng)液II為10%胎牛血清(FBS)+90% DMEM ;消化液為含有0.25%胰酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)的磷酸鹽緩沖液(PBS) ο
[0011]步驟二、真皮層構(gòu)建
[0012]取第5?10代成纖維細(xì)胞，按照每毫升培養(yǎng)液III含0.5 X 16?3 X 10 6個(gè)成纖維細(xì)胞進(jìn)行接種，置于5% C02、37°C條件下培養(yǎng)2?3小時(shí)，加入培養(yǎng)液IV培養(yǎng)；每隔22?26小時(shí)更換培養(yǎng)液IV—次，共培養(yǎng)12?14天。
[0013]其中培養(yǎng)液III是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比9:1的FBS，添加50?100mg/L的維生素 c (Vc);培養(yǎng)液IV為 75 % DMEM+25 % DMEM/F12 (體積比為 3:1)，添加 NaHCO3S 3 ?5mg/ml，孕酮30?50nM，丁二胺30?60 μ Μ，砸酸鈉10?20ηΜ，50?100mg/L的維生素C，胰島素15?30ng/ml，胎牛血清3?10%，氫化可的松150?180ng/L，腺嘌呤55?75 μ g/ml，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8?12ng/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白10?20ng/ml，血管生長(zhǎng)因子5?1ng/ml ο
[0014]步驟三、表皮層構(gòu)建
[0015]將培養(yǎng)液IV吸棄，將準(zhǔn)備好的第3?7代表皮細(xì)胞按0.1 X 15?1.5 X 10 5個(gè)/cm2接種于真皮層表面，加入培養(yǎng)液V -SKl培養(yǎng)；置于5% C02、37°C條件下培養(yǎng)，每隔22?26小時(shí)換液一次，共培養(yǎng)48小時(shí)，得到雙層皮膚。其中，培養(yǎng)液V -SKl:培養(yǎng)液IV +表皮生長(zhǎng)因子(0.6?2ng/ml) +角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF) (0.5?5ng/ml) +粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF) (2.5 ?10ng/ml)；
[0016]步驟四、全層皮膚的培養(yǎng)
[0017]將制備的雙層皮膚取出，放在培養(yǎng)支架表面，加入培養(yǎng)液V -SKl進(jìn)行氣液面培養(yǎng)；培養(yǎng)48h后更換為培養(yǎng)液V -SK2，進(jìn)行氣液面培養(yǎng)；培養(yǎng)48h后更換為培養(yǎng)液V -SK3，液面與皮膚表面平齊；培養(yǎng)48h后更換為培養(yǎng)液V -SK4，液面與培養(yǎng)支架平齊，繼續(xù)培養(yǎng)至結(jié)束，得到全層皮膚。
[0018]步驟四中的培養(yǎng)條件均為37°C，5% CO2環(huán)境。
[0019]其中，培養(yǎng)液V -SK2:培養(yǎng)液IV +氯化鈣(15?30 μ g/ml)+維生素C(50?100 μ g/ml)+表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(20?25ng/ml);培養(yǎng)液V-SK3:培養(yǎng)液IV +氯化鈣(150?200 μ g/ml)+維生素C(50?100 μ g/ml) +表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(20?30ng/ml);培養(yǎng)液V -SK4:培養(yǎng)液IV +氯化鈣(I?20mg/ml) +表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(10?35ng/ml)。
[0020]本發(fā)明所構(gòu)建的模型，是通過維生素C誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞快速增殖并大量分泌胞外基質(zhì)，胞外基質(zhì)與細(xì)胞均勻分布和排列形成的多層細(xì)胞膜片，其厚度達(dá)到200?300 ym ;膜片形成后在膜片上進(jìn)行表皮細(xì)胞接種，接種后進(jìn)行復(fù)層化培養(yǎng)，待表皮復(fù)層化且厚度達(dá)到150?200 μ m后，全層皮膚模型構(gòu)建成功。
[0021]本發(fā)明對(duì)全層皮膚模型進(jìn)行了構(gòu)建工藝上的創(chuàng)新，無需添加外源支架材料，通過真皮層發(fā)育和三維培養(yǎng)體系的建立，促使真皮層的細(xì)胞大量分泌膠原并形成成熟的胞外基質(zhì)，在細(xì)胞復(fù)層化的過程中胞外基質(zhì)又為細(xì)胞提供了天然的三維支架和生長(zhǎng)空間，最大程度保留和提高了真皮層細(xì)胞分泌的活性因子，構(gòu)建了接近天然皮膚的細(xì)胞微環(huán)境及皮膚結(jié)構(gòu)；同時(shí)，通過多次接種與細(xì)胞增殖自身的復(fù)層化過程相結(jié)合，增加了真皮層的厚度、機(jī)械強(qiáng)度、穩(wěn)定性；此外，在真皮層的構(gòu)建過程中避免了外源材料的添加；真皮層與表皮結(jié)合后，培養(yǎng)液能夠滿足真皮層和表皮層細(xì)胞的活性及生物學(xué)功能的發(fā)揮，避免真皮層不生長(zhǎng)和降解的發(fā)生，同時(shí)真表皮連接緊密并形成良好的基底膜結(jié)構(gòu)。如此完整的皮膚模型，可用于替代動(dòng)物、人體皮膚組織開展活性物質(zhì)的安全性與功效性檢測(cè)。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所使用的細(xì)胞培養(yǎng)膜片技術(shù)能促進(jìn)細(xì)胞形成較好的胞外基質(zhì)和促進(jìn)細(xì)胞三維生長(zhǎng)的支架結(jié)構(gòu)，以保證細(xì)胞的活力和生物學(xué)功能。較現(xiàn)有采用膠原做支架材料復(fù)合成纖維細(xì)胞構(gòu)建真皮的方法，避免了成纖維細(xì)胞在構(gòu)建過程中降解外源膠原和自分泌膠原進(jìn)行重新組裝的過程。本發(fā)明最大程度地重現(xiàn)了細(xì)胞在體內(nèi)參與組織形成的過程。避免膠原降解過程中出現(xiàn)的支架收縮而導(dǎo)致的表皮層與真皮層結(jié)合不緊密，出現(xiàn)氣液面控制不準(zhǔn)確、表皮層細(xì)胞過度角質(zhì)化等問題。
[0023]與現(xiàn)有產(chǎn)品相比，本發(fā)明所制備的全層皮膚具有以下優(yōu)點(diǎn):
[0024](I)具有較好的真表皮結(jié)構(gòu)，成纖維細(xì)胞分泌膠原并復(fù)層化替代以支架材料為載體的真皮層，厚度及細(xì)胞分布密度與天然皮膚接近；
[0025](2)與在外源支架材料基礎(chǔ)上構(gòu)建的皮膚模型相比，其胞外基質(zhì)主要由真皮細(xì)胞自分泌形成，避免了在測(cè)試過程中因外源支架材料的存在而影響測(cè)試結(jié)果；
[0026](3)多批次的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所用的細(xì)胞膜片技術(shù)制備的真皮層，其厚度、細(xì)胞數(shù)量以及組織活力可以做到穩(wěn)定控制；
[0027](4)真皮層細(xì)胞具有較好的由自身分泌胞外基質(zhì)形成的微環(huán)境，有利于細(xì)胞活性與功能的保持；
[0028](5)真皮層與表皮層結(jié)合緊密，真表皮結(jié)構(gòu)與天然皮膚結(jié)構(gòu)一致；
[0029](6)無外源材料支架的真皮層含有更多成纖維細(xì)胞分泌的因子與保外基質(zhì)，能更好的促進(jìn)和支持表皮增殖與分化；
[0030](7)不收縮，與小室形成密閉的實(shí)體；
[0031](8)應(yīng)用范圍廣，可用于化妝品、小分子化合物、活性蛋白、醫(yī)療器械、化學(xué)品、一次性衛(wèi)生用品、與皮膚接觸材料的安全性與功效性評(píng)價(jià)。
[0032]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
【附圖說明】
[0033]圖1為全層皮膚的組織學(xué)切片照片。其中b是表皮層，a是真皮層。
[0034]圖2為全層皮膚進(jìn)行化妝品原料有效性測(cè)試應(yīng)用過程照片
[0035]其中，圖2-1為全層皮膚進(jìn)行化妝品原料有效性測(cè)試樣品孵育照片；
[0036]圖2-2為全層皮膚進(jìn)行化妝品原料有效性測(cè)試樣品孵育后皮片清洗照片；
[0037]圖2-3為全層皮膚進(jìn)行化妝品原料有效性測(cè)試樣品孵育后活性指示劑溶出示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0038]實(shí)施例1.一種全層皮膚模型的構(gòu)建方法，包括以下步驟:
[0039]步驟一、成纖維細(xì)胞和表皮細(xì)胞的分離培養(yǎng):成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)，將已去除脂肪和結(jié)締組織的包皮組織切成Imm3的皮膚組織置于含有膠原酶200U.ml '透明質(zhì)酸300U.ml—1的培養(yǎng)基I中，放置4°C過夜，再加入等體積的消化液，37°C空氣搖床180rpm20min后終止消化；100rpm離心1min收集細(xì)胞；用含有培養(yǎng)液II調(diào)整細(xì)胞密度2 X 15個(gè)/cm2細(xì)胞接種，5.0% CO 2、37°C條件下培養(yǎng)；
[0040]表皮細(xì)胞分離培養(yǎng)，將表皮層組織浸沒于1.2U/mL的消化液中，置入4°C條件下20h;在無菌條件下撕下表皮層，將表皮層放入37°C預(yù)熱的消化液中，在37°C條件下，消化1min后終止，每2min震蕩3下；無菌200目篩網(wǎng)過濾，800r/min離心6min后棄上清；加入37°C預(yù)熱的PBS緩沖液，吹打至均勻后再次800r/min離心6min后棄上清，加入培養(yǎng)液I，吹打至均勻；按照3X 1Vcm2的密度接種，移入5% C02、37°C條件下培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞用于構(gòu)建。
[0041]其中培養(yǎng)液I為DMEM，含有谷氨酰胺5mM、孕酮ΙΟηΜ、丁二胺35 μ M、砸酸鈉15ηΜ、轉(zhuǎn)鐵蛋白65ng/ml (sigma);培養(yǎng)液II為10% FBS+90% DMEM ;消化液為含有0.25%胰酶和0.02% EDTA 的 PBS0
[0042]步驟二、真皮層構(gòu)建:取P7代的成纖維細(xì)胞，每Iml培養(yǎng)液III含1.1 X 16個(gè)成纖維細(xì)胞，取0.2mL接種于0.5cm2的trans-well小室；放入含5% CO 2、37°C孵箱中培養(yǎng)3小時(shí)，加入培養(yǎng)液IV ;每隔22小時(shí)更換培養(yǎng)液IV—次，共培養(yǎng)12天。
[0043]