一種制備無血清培養的懸浮哺乳動物細胞系的方法、及其制備的細胞系和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種適應單細胞純懸浮無血清培養的哺乳動物細胞系的馴化方法以 及使用該方法制備的細胞系。
【背景技術】
[0002] 哺乳動物細胞的培養經歷了滾瓶-微載體的培養模式。培養模式的改進，不但更 容易實現規模化生產，而且降低了后期純化工藝的難度。
[0003] 轉瓶培養技術是傳統的貼壁細胞培養方式，將細胞接種在旋轉的圓筒形轉瓶中， 細胞貼附于玻璃壁四周，培養過程中轉瓶在軸承上不斷旋轉，使細胞能夠交替接觸培養液 和空氣，實現細胞生長代謝的目的。
[0004] 滾瓶培養工藝不能對培養液組分、pH以及DO等條件實時控制調整，無法保證細胞 處于最佳的生長狀態，不能實現工業的大規模生產；滾瓶培養工藝繁瑣復雜，周期長，勞動 強度大，占地空間大，費時費力，且批次間差異較大，生產質量難以控制，產品質量不穩定。
[0005] 微載體培養技術成為目前大規模培養應用較多的一項工藝，常使用的載體有兩 種，一種是片狀載體，一種是球狀載體。細胞在載體表面呈現單層生長，實現了在相當少的 空間生產高密度的細胞和細胞產物。
[0006] 微載體的價格昂貴，生產成本高，對動物疫苗生產不適合。而且微載體培養細胞過 程中需要添加一定量的血清，不利于流感病毒的增殖；血清添加產生的副作用較大，后期純 化工藝困難。此外，培養基中添加了動物源血清使得在病毒培養或疫苗生產中遭受外源污 染的風險大大提商，并且生廣成本提商。
[0007] 流感病毒疫苗的制備經過了從動物組織器官到細胞培養的規模化發展過程，流感 病毒的培養經歷了從雞胚到哺乳動物細胞的發展過程，因此，基于以上考慮，開發出一種 適合流感病毒無血清純懸浮培養制備流感疫苗工藝具有重要意義。
【發明內容】
[0008] 為解決現有技術的不足，本發明提供了一種適應單細胞純懸浮無血清培養的哺乳 動物細胞系的馴化方法以及使用該方法制備的細胞系。
[0009] 本發明的主要目的在于提供一種制備無血清培養的懸浮哺乳動物細胞系的方法， 所述方法包括：（1)復蘇并培養哺乳動物細胞，得到貼壁培養的所述哺乳動物細胞，用胰酶 消化；（2)用添加了一定量血清的無血清培養基培養所述貼壁培養的哺乳動物細胞，連續 培育所述哺乳動物細胞至適應所述添加了一定量血清的無血清培養基；以及（3)重復步驟 (2)中的所述連續培育程序，逐漸降低所述無血清培養基中的血清添加量，直到所述無血清 培養基中血清添加量為〇,得到所述懸浮培養的哺乳動物細胞。
[0010] 優選地，所述步驟（1)中的哺乳動物為MDCK細胞。
[0011] 優選地，所述步驟（2)和（3)中的所述無血清培養基包括VP-SFMAGT?、MDCK細胞 無血清無蛋白化學培養基、InVitrus?、或SFM4MegaVir?培養基以及在所述步驟（3)中當 血清添加量為1%及以下時，所述無血清培養基還包括添加成分Pluronic F-68和硫酸葡聚 糖。
[0012] 優選地，所述步驟（2)中所述血清添加量為5% ;所述步驟（3)中所述逐漸降低的血 清添加量分別為3%、1%、0. 5%、0%。
[0013] 優選地，所述步驟（2)和（3)中的連續培養所述哺乳動物細胞至適應所述添加了 一定量血清的無血清培養基的程序為連續培養3~5代。
[0014] 本發明的另一目的在于提供所述方法制備的所述懸浮培養的哺乳動物細胞系。
[0015] 本發明的再一目的在于提供一種制備流感病毒疫苗的方法，所述方法包括，（1)用 所述無血清培養基擴增培養所述懸浮培養的哺乳動物細胞；（2)在所述步驟（1)中培養的 所述懸浮培養的哺乳動物細胞中接種所述流感病毒，擴增培養所述流感病毒；以及（3)收 獲所述流感病毒，滅活。
[0016] 具體而言，復蘇一支凍存的已經適應無血清懸浮培養的MDCK細胞，復蘇方法為： 液氮中取出細胞一支，迅速放入37°C水浴鍋中溶解。75%酒精擦拭后放入超凈工作臺，Iml 吸管吸出細胞輕輕加入15ml離心管中，然后加入IOml生長液(成分是VP-SFM AGT?(Gibco 公司）無血清培養基、0. l%Pluronic F-68、30 μ g/ml硫酸葡聚糖)，生長液應該逐滴滴入， IOml液用時不少于2min,混勻后800rpm,離心3min。棄上清，加入新鮮生長液IOml,輕輕 吹打混勻，將細胞懸液放入100mL三角瓶中，補足生長液30ml搖床培養。培養2d后離心換 液。
[0017] 當細胞生長速率恢復后，將細胞擴大培養在Biofloll5發酵罐，工作體積I. 2L，培 養液組成為：〇. 2%Pluronic F-68、30y g/ml 硫酸葡聚糖、VP-SFM AGT?(Gibco 公司）；培養 條件為：37°C、80~110rpm、D030~50%、ρΗ7· 20 ;細胞接種密度為30~50萬/ml。
[0018] 待細胞密度達到3X IO6~4X l〇7ml時，接種流感病毒，接種劑量為MOI=0.00 1~ 〇. 1，另外培養基中添加 1.0~5.0 μ g/ml的TPCK-胰酶(購自Sigma公司）；培養條件為： 33°C、80~110rpm、D030~50%、ρΗ7· 20。80%細胞出現病變、死亡時停止培養，收獲病毒液， 測定血凝效價。
[0019] 優選地，所述無血清培養基包括VP-SFM AGT?、MDCK細胞無血清無蛋白化學培養 基、InVitrus?、或SFM4MegaVir?培養基以及所述無血清培養基中的添加成分Pluronic F-68和硫酸葡聚糖。
[0020] 優選地，所述流感病毒為禽流感病毒、豬流感病毒。
[0021] 本發明的又一目的在于提供所述方法制備的流感病毒疫苗。
[0022] 本發明具有以下有益效果：
[0023] 1.解決了細胞傳統轉瓶培養工藝繁瑣復雜，不易實現大規模生產的問題。懸浮 培養細胞可以使細胞獲得均衡的營養，可以直觀地反映細胞生長代謝的過程，簡化了生產 工藝、節省了人力、降低了生產成本，保證了疫苗的穩定性和均一性，且實驗操作簡單、周期 短。純懸浮培養既可以選擇灌注培養又可以選擇流加培養。流加工藝采用不斷補充細胞生 長過程中所消耗的營養，來延長細胞生長時間，從而達到細胞高密度，培養病毒的高含量。
[0024] 2.解決了微載體價格昂貴的問題。純懸浮培養工藝使細胞懸浮在培養罐中，不需 要依附微載體生長，在攪拌力的作用下懸浮在培養基中生長。
[0025] 3.解決了血清添加產生副作用的問題。采用無血清培養基使得在病毒培養或疫苗 生產中遭受外源污染的風險降低，且降低了動物的應激反應，安全系數高，也使得后續病毒 處理如過濾、純化等步驟更加簡單易行，大大減少了工作量。
【附圖說明】
[0026] 圖1為生物反應器培養過程中懸浮細胞與貼壁細胞生長曲線，圖中Viability 代表的是懸浮培養細胞的存活率；Cell density代表的是懸浮培養的細胞密度； adherent-cell代表的是貼壁細胞的密度；
[0027] 圖2為本發明MDCK細胞懸浮培養與貼壁培養的流感病毒血凝價比較。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述更 為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人 員應該理解的是，在不偏離本發明的精神