新型重組抗蟲蛋白及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及抗蟲蛋白及生物安全技術領域，具體設及一種新型重組抗蟲蛋白及其 制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 蘇云金芽胞桿菌炬acillus thuringiensis，簡稱化），化基因即是蘇云金芽胞桿 菌基因，其編碼的化毒蛋白能被蘇云金芽胞桿菌分泌到菌體外，20世紀50年代中期，科學 家發現化毒蛋白對鱗翅目、銷翅目等昆蟲的毒性來自于抱子形成過程中產生的晶體蛋白 質，1981年，科學家提純了該種蛋白質并命名為化y，隨后他們克隆出了化y的基因。蘇云 金芽胞桿菌殺蟲晶體蛋白Cry ( W下簡稱為CiT蛋白）是根據氨基酸同源性的不同進行分 類的；同源性在45% W下，為第一等級，用阿拉伯數字表示；同源性在45%~78%之間，為 第二等級，用大寫英文字母表示；同源性在78%~95%之間，為第S等級，用小寫英文字母 表示；同源性在95% W上，為第四等級，用阿拉伯數字表示，例如化ylAclO蛋白。
[000引不同蛋白特異性毒殺昆蟲的種類不同，該主要取決于蛋白與昆蟲中腸道 上皮細胞膜上的受體相互作用的結果（Knowles B.等，1993)。相關的研究表明，化y蛋白的 毒性與毒性膚和膜受體的結合力呈正相關Olofmann C.等，1989)，一般是化y蛋白W原毒 素的形式存在，在堿性條件下溶解，在蛋白酶作用下水解掉C端非活性部位而變成活性毒 性膚，此活化的毒性膚與昆蟲中腸道膜上的受體結合，毒性區結構域I的a螺旋使膜穿孔， 從而破壞膜細胞的滲透平衡；結構域II具有與中腸道上皮細胞膜結合的能力，與受體結合 W及決定祀標昆蟲特異性；結構域III為穩定與毒素受體的結合、決定特異性W及口控離 子通道，可應用于人為的化y蛋白分子改造，改造可能會影響到對毒素受體的識別，改變親 代毒蛋白的抗蟲譜及抗蟲活力。
[0004] 1991年，化rlak等人通過兩種方法對hylAb蛋白進行改造，其一是在不改變 化ylAb蛋白氨基酸順序的基礎上，通過點突變方法對化ylAb蛋白進行部分改造，即改變 3%堿基序列，其二是在保持化ylAb蛋白活性中屯、與結構的前提下，按照高等植物所偏愛 密碼子的原則，通過人工合成方法對hylAb蛋白進行完全改造，即改變21 %堿基序列。 1995年，Ballcster等人發現對甜菜夜蛾沒有毒性的化ylE蛋白和化ylAb蛋白，兩者的結 構域III分別被具有毒性的化ylC蛋白的結構域III取代后都具有了毒性；對煙芽夜蛾低 毒的化ylAa蛋白的結構域III被毒性更高的化ylAc蛋白的結構域III置換后，能夠增加 化ylAa蛋白的毒性。2006年，郭青云等人通過體外重組的方法實現了化ylAa蛋白和化yl化 蛋白的功能性結構域I、II、III互換，得到了 6株蘇云金芽抱桿菌重組菌株，經過對各雜交 殺蟲晶體蛋白獨立測定，發現比野生型殺蟲晶體蛋白毒力減弱，從而證明了殺蟲晶體蛋白 不同結構域的相互作用會影響雜交殺蟲晶體蛋白的表達、晶體形態和殺蟲活性。
[000引化y蛋白家族中，化ylAb蛋白、化ylAc蛋白和化y9C蛋白對亞洲玉米懼的殺蟲活 性最強，商品化轉基因抗蟲玉米中主要應用編碼上述S種蛋白的化ylAb基因XrylAc基因 和&y9C基因。目前，基因的獲得主要是從天然蘇云芽抱桿菌或自然宏基因組文庫中 克隆，并進一步利用大腸桿菌表達、抗蟲性鑒定等研究策略高通量篩選新型抗蟲基因。物種 之間通過不斷的加速進化競爭性生存，W病毒蛋白進化為例，進化率越快的病毒蛋白具有 越高的與宿主蛋白結合的能力，即；侵染能力越強。但由于自然界菌株變異速率相對較慢， 獲得更高抗蟲性的化y蛋白越來越困難，因此，獲得進化率快的化y基因對于高抗蟲材料的 獲得至關重要。
[0006] 通過轉基因技術，可W將抗蟲基因導入玉米品種中，進而提高轉基因玉米的抗蟲 性，降低農藥的使用量，節省人力、物力及社會資源。因此，應用新的高抗昆蟲蛋白、提高殺 蟲蛋白的表達量W及培育新型轉基因抗蟲玉米是解決上述問題的最有效途徑之一。美國的 科學家把基因轉入玉米和棉花中，轉基因玉米和棉花在美國成功地上市，至今未發現 它們對人類有任何負面影響，該種轉基因作物對于環境的貢獻是巨大的。在中國，也有許多 科學家在致力于轉化基因玉米的研究。中國農業大學的王國英教授研究的轉化基因玉米 已經在國內進行了環境釋放。轉化基因玉米在中國的商業推廣將給玉米生產和種植者帶 來極大的收益。中國自2008年國家啟動《轉基因生物新品種培育科技重大專項》后，在轉 基因抗蟲玉米品種培育方面雖有些報道，但卻沒有能夠最終商業化，該主要歸結于化基因 的抗蟲效果及轉化植株的穩定性。
【發明內容】
[0007] 為了獲得更高抗蟲活性的抗蟲蛋白，本發明提供一種新型重組抗蟲蛋白及其制備 方法和應用。
[000引本發明提供的一種新型重組抗蟲蛋白，該蛋白的氨基酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 1所示，編碼該蛋白的抗蟲基因NGc的核巧酸序列如序列表中的SEQ ID NO:2所示。
[0009] 本發明還提供一種含有上述抗蟲基因NGc的植物表達NGc蛋白載體 pTFlOl. 1-ubi-NGc，該載體的核巧酸序列如序列表中的SEQ ID N0:3所示。
[0010] 進一步的，通過對載體pTFlOl進行改造來構建植物表達NGc蛋白載體 pTFlOl. 1-ubi-NGc ;在載體pTFlOl原有架構的基礎上，選擇除草劑抗性基因bar為篩選標 記基因，由啟動子2XP35S驅動，由終止子Tvsp終止篩選標記基因bar轉錄；由啟動子ubi 啟動抗蟲基因NGc表達，由終止子nos終止抗蟲基因NGc轉錄，通過啟動子ubi驅動將抗蟲 基因NGc分別連接入載體pTFlOl的Smal位點和SacI位點，構建植物表達NGc蛋白載體 pTFlOl. 1-ubi-NGco
[001U 進一步的，所構建的植物表達NGc蛋白載體pTFlOl. l-ubi-NGc包括；
[001引啟動子ubi,為玉米基因組基因ubi,長2022bp，負責啟動抗蟲基因NGc表達；
[0013] 終止子nos,為根癌農桿菌Ti質粒T-DNA區姻脂堿合成酶基因，長268bp，負責終 止抗蟲基因NGc轉錄；
[0014] 篩選標記基因bar,為除草劑抗性基因bar,來源于吸水鏈霉素，編碼區55化P，編 碼184個氨基酸；
[0015] 啟動子2XP35S，來自花挪菜花葉病毒CaMV，長663bp，負責啟動篩選標記基因bar 表達；
[0016] 終止子Tvsp,長65化P，負責終止篩選標記基因bar轉錄。
[0017] 本發明還提供了上述新型重組抗蟲蛋白的制備方法，該方法通過W下步驟實現：
[001引步驟一、化y蛋白家族改造區域的確定
[0019] 從NCBI數據庫中查找蛋白家族中&ylA105蛋白、hylAal蛋白、hylAbl蛋 白、CrylAbS 蛋白、CrylAbH 蛋白、CrylAcl 蛋白、CrylAhl 蛋白、CrylBal 蛋白、CrylBbl 蛋 白、CrylBel 蛋白、CrylBfl 蛋白、CrylFal 蛋白、CrylGc 蛋白、Cryllal 蛋白、Cryllfl 蛋白、 Cryljal 蛋白、Cryljbl 蛋白、Cryljcl 蛋白、Cry2Abl 蛋白、Cry2Acl 蛋白、Cry2Ael 蛋白、 化y9Aal蛋白、化y9Cal蛋白、化y犯cl蛋白的氨基酸序列；利用pMAL算法和perl編程語 言，采用進化率分析方法，確定在分子進化過程中蛋白氨基酸序列的高進化活性區域；
[0020] 將分析得到的高進化活性區域分為區域A~F，區域A為氨基酸位點在36~120 之間，區域B為氨基酸位點在121~254之間，區域C為氨基酸位點在255~360之間，區 域D為氨基酸位點在361~461之間，區域E為氨基酸位點在462~539之間，區域F為氨 基酸位點在540~606之間，化y蛋白的氨基酸序列中共有150個位點的氨基酸殘基具有 進化活性，即位點Ka/Ks〉l，Ka為氨基酸突變率，Ks為同義突變率，其中進化活性較高的位 點有45個，即位點Ka/Ks〉l. 45,該45個位點的氨基酸殘基分布為：區域A有1個高進化活 性的氨基酸殘基，區域B有2個高進化活性的氨基酸殘基，區域C有12個高進化活性的氨 基酸殘基，區域D有3個高進化活性的氨基酸殘基，區域E有16個高進化活性的氨基酸殘 基，區域F有11個高進化活性的氨基酸殘基，因此，區域A和區域B均為保守區域，區域C、 區域D、區域E和區域F為高進化活性區域；
[0021] 步驟二、構建新型抗蟲基因庫
[0022] (1)選取NCBI數據庫中具有抗鱗翅目蟲活性的基因建立數據集，通過BLAST進行 局部相似性比對；
[0023] 根據四級核巧酸同源性差異選擇基因：
[0024] CrylAbl基因、CrylAbS基因、CrylAbH基因；核巧酸同源性大于95% ;
[002引 CrylAb基因、CrylAc基因、CrylAh基因；核巧酸同源性在78%~95%之間；
[0026] 化ylA基因、化ylB基因、化ylF基因、化ylG基因、化yll基因、化ylj基因；核巧酸 同源性在45 %~78 %之間；
[0027] 基因、基因、&y9基因；核巧酸同源性低于45%;
[002引 （2)采用最大簡約法建立系統進化樹；首先采用Clustalx2. 0軟件對所選的化y 基因進行多重比對，再利用MEGA 5軟件建立取代模型，同時建立化y蛋白氨基酸序列系統 進化樹并評估系統進化樹；
[0029] (3)根據系統進化樹上顯示的氨基酸序列進化親緣關系，選擇核巧酸同源性在 78 %~95 %之間的基因，即選取CrylAb基因、CrylAc基因、CryIBa基因、CryIGc基因、 hylla基因、hyljb基因、&y2Ae基因、&y9化基因作為代表，從NCBI數據庫中查找 CrylAb 基因、CrylAc 基因、CrylBa 基因、CrylGc 基因、Crylla 基因、CryUb 基因、Cry2Ae 基因、化y9化基因的編碼序列；
[0030] (4)區域A和區域B均為保守區域，將區域A和區域B合成為一個區域A+B，選取 化ylAb基因作為區域A+B的供體，合成化ylAb基因N端區域A+B的編碼序列，獲得長度為 1~1410bp的基因片段，編碼N端1~470個氨基酸；
[0031] 區域C、區域D、區域E和區域F均為高進化活性區域，將區域C和區域D合成為一 個區域C+D，將區域E和區域F合成為一個區域E