一種分離dna結合蛋白并精確定位其dna結合位點的方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及DNA結合蛋白，具體地說，設及一種分離DNA結合蛋白并精確定位其 DNA結合位點的方法。
【背景技術】
[0002] 目前對啟動子DNA結合蛋白的研究方法可分為兩大類。第一類是細胞內方法， W已知的啟動子DNA序列篩選與其相結合的蛋白編碼基因，通過生物信息學分析來確定 該蛋白質，如酵母單雜交系統（yeastonehybridsystem,Y1H)、瞻菌體展示技術（phage display,PD)等。第二類是細胞外法，即在體外用重組的已知蛋白質與啟動子DNA結合，如 凝膠阻滯實驗、面aseI足跡試驗等。
[0003] 細胞內方法由于是細胞內篩選，符合生理狀態，適合高通量篩選用于尋找未知基 因及蛋白質，但是只能篩選可與啟動子DNA特異性結合的蛋白，但不能檢查出精確的蛋白 質結合位點，而且其特異性需要進一步驗證。細胞外法可W查出精確的蛋白質結合位點，但 效率低下、操作復雜，一般不用于尋找未知基因及蛋白質。
【發明內容】
[0004] 為了解決現有技術中存在的問題，本發明的目的是提供一種可W尋找潛在DNA結 合蛋白并且可W對其與DNA結合位點進行精確定位的方法。
[0005] 為了實現本發明目的，本發明的技術方案如下：
[0006] 一種分離DNA結合蛋白并精確定位其DNA結合位點的方法，
[0007] 分離DNA結合蛋白；通過利用帶有生物素標記的引物PCR擴增待研究DNA片段， 先后加入核蛋白或胞質蛋白和親和素包被的磁珠，共同解育，洗去非特異結合的蛋白，加入 SDS使蛋白質變性釋放，鑒定蛋白質；
[000引該樣擴增的每個PCR片段末端都帶有一個生物素基團，生物素與親和素包被磁 珠（Str巧tavidinSe地arose)結合，而親和素包被磁珠又可W與帶吸力真空準備工具 (vacuumpr巧tool)結合，從而被分離出來。
[0009] 定位蛋白質的DNA結合位點：W待研究的DNA片段為模板，采用不同的引物通過 PCR反應獲得相互重疊的DNA片斷，根據相互重疊的DNA片斷對結合蛋白親和力的差異定位 結合蛋白的DNA結合位點。
[0010] 進一步地，所述方法具體包括如下步驟：
[0011] S1;DNA片段的擴增；
[001引 W待研究的DNA片段為模板，利用帶有生物素標記的引物通過PCR反應進行 擴增；經1 %瓊脂糖凝膠電泳，切下帶有目的片斷的凝膠回收純化，獲得純的DNA片斷 (0. 5-3.Oug)；
[001引 S2;蛋白質的分離；
[0014] PCR產物中加入核蛋白或胞質蛋白，共同解育；
[0015] 加入親和素包被的磁珠，共同解育；
[0016] 緩沖液洗去非特異結合的蛋白；
[0017] 加入SDS使蛋白質變性釋放，鑒定蛋白質；
[00化]S3 ;定位蛋白質的DNA結合位點；
[0019] W待研究的DNA片段為模板，采用不同的引物通過PCR反應獲得相互重疊的DNA 片斷；
[0020] 根據上述相互重疊的DNA片斷對結合蛋白親和力的差異定位結合蛋白的DNA結合 位點。
[002U 更進一步地，所述待研究的DM片段為200-3(K)bp。
[0022] 所述步驟S1中任意一條引物的5'末端采用生物素標記。
[0023] 進一步地，所述步驟S2具體為：
[0024] 1)在96孔板中預先加入30yLdd&O;
[002引 2)100化PCR產物中加入50化核蛋白或胞質蛋白，37°C解育15分鐘；
[0026] 扣StreptavidinSe地arose?HP(鏈霉親和素瓊脂糖凝膠）混勻，取6yL加入到 46uLbindingbuffer(結和緩沖液），W吸頭混勻5分鐘，混合物加入到含有PCR產物-蛋 白混合物的96孔PCR反應板；
[0027] 4)在Vacuumprepworkstation(真空準備工作站）中，四個樣品板中依次加入 180ml高純水、Denaturationbuffer(變性緩沖液）、washingbuffer(清洗緩沖液）和 PBS(磯酸緩沖液）；
[002引 5)打開vacuumprepworkstation(真空準備工作站）的抽氣累，將vacuumprep tool(真空準備工具）在高純水中清洗30秒；
[0029] 6)將vacuumpr巧tool(真空準備工具）移到PCR板中，抓取親和素包被磁珠-生 物素-DNA-蛋白質復合物；
[0030] 7)將vacuumpreptool(真空準備工具）在Dena1:urationbuffer(變性緩沖 液）、washingbuffer(清洗緩沖液）或PBS(磯酸緩沖液）中洗漆15秒；
[003U 8)關掉抽氣累，將vacuumpr巧tool(真空準備工具）放入含有超純水的96孔板 中，搖動，釋放混合物；
[003引 9)吸取混合物，放入離屯、管中，-20°C保存；
[003引 10)DNA結合蛋白的鑒定。
[0034] 其中，DNA結合蛋白的鑒定通過本領域常規方法鑒定，如；SDS-PAGE、凝膠阻滯實 驗室或色譜法鑒定。
[0035] 本發明的有益效果在于：
[0036] 本發明采用生物素-親和素作用方法來確定與啟動子結合蛋白，方法簡便易行， 且周期較短；并且通過PCR反應控制PCR產物的長度和位置，且能方便的引入基因突變，W 及適應于大通量的篩選，因此該方法即可用于大通量的分析與DNA結合的蛋白質，又可準 確定位蛋白在DNA上的作用位點，并可通過引入突變來判斷其與位點的結合特異性。
【附圖說明】
[0037] 圖1為本發明實施例中樣本在12%的SDS-PAGE上電泳圖；
[003引蛋白質分子量標準自上至下分別是97、66、44、31、21和141^);1和2分別是提取的 核蛋白和胞質蛋白，D1和D2分別是處理后經dena化rationbuffer洗漆的核蛋白和胞質 蛋白，化和W2分別是處理后經washingbuffer洗漆的核蛋白和胞質蛋白，P1和P2分別是 處理后經PBS洗漆的核蛋白和胞質蛋白。
[0039] 圖2為本發明實施例中與啟動子片段結合的蛋白的凝膠阻滯試驗檢測結果。
[0040] 圖3為本發明所述分離DNA結合蛋白并精確定位其DNA結合位點的方法示意圖。
【具體實施方式】
[0041] 本實施例WhCLP46基因啟動子CpG島結合蛋白為例，用于說明本發明技術方案， 但不用來限制本發明的范圍。
[00創實施例1hCLP46基因啟動子CpG島結合蛋白的分離與結合位點的定位 [004引 l、hCLP46啟動子區的擴增
[0044] 應用PrimerPremier5.0設計引物（表1)，100uL反應體系中包含10XPCR Buffer10uL，2. 5mMdNTPmix8yL，各 4.OuLlOuM上、下游引物，2.OuLU937DNA， l.OyL5U/yL化qCTakaRa)和71.0yLd地20。混合物混勻離屯、后在PCR儀上執行擴增 反應（95°C3min;95°C30s，59°C30s，72°CImin，45cycles;72°C5min;4°Cforever)。
[0045] 表1h化P46啟動子擴增引物
[0046] 基因名稱_序列(5,一3)_片斷長度
[0047] _(bp) hCLP46 F Biotin-CAACTGGTCCATTCGTTTATC 490 啟動子民TCCAGAGCAGGAGCAGAG_
[0048] 2、U937細胞胞質蛋白和核蛋白提取
[0049] U937細胞按照上述方法進行培養，使用核蛋白和胞質蛋白提取試劑盒（南京凱 基）提取細胞核蛋白和胞質蛋白，簡略步驟如下：
[0050] 1)取培養的U937細胞5X106~lX107個/mL，棄去培養液，細胞用預冷的PBS洗 漆兩遍；
[0化^ 2)用1血預冷的PBS洗漆細胞后轉移至預冷的1. 5血微量離屯、管中；
[0052] 3)4°C離心500Xg，3min收集細胞，用移液槍盡可能取去上清，勿留殘液，估計細 胞壓積PCV (離屯、后的緊實細胞體積）；
[005引4)每20 y 1細胞壓積中，加入200 y 1預冷的Buffer A (使用前每血Buffer A 加入1 y 1 DTT，5 y 1 PMSF，10 y 1蛋白酶抑制劑），最大轉速禍旋劇烈振蕩15s，放置冰上 15min；
[0化4] 5)加入11 y 1冷Buffer B，最大轉速禍旋劇烈振蕩5s，放置冰上Imin ;
[0055] 6)再次最大轉速禍旋劇烈振蕩5S后，4°C離屯、，16000Xg，5min ;
[0化6] 7)盡快將上清轉入另一預冷的潔凈微量離屯、管，置于冰上，即得胞質蛋白；
[0化7] 8)在離屯、沉淀物（細胞核）中加入100y1預冷的BufferC(使用前每血Buffer C加入1y1DTT，5y1PMSF，10y1蛋白酶抑制劑），最大轉速禍旋劇烈振蕩15S，放置冰上 40min，每間隔lOmin禍旋劇烈振蕩15S;
[0化引 9) 4°C離心16000Xg，lOmi