具有抗原結合和多價FCγ受體結合活性的分子的制作方法
【專利說明】具有抗原結合和多價FC γ受體結合活性的分子
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2012年8月20日提交的美國臨時申請號61/691，057和于2013年 3月14日提交的美國臨時申請號61/785, 144的優先權，所述申請的內容通過引用整體并入 本文。
[0003] 以電子方式提交的文本文件的描述
[0004] 隨本文以電子方式提交的文本文件的內容通過引用整體并入本文：序列表的計算 機可讀格式副本（文件名：GLIK_009_01US_310975_2048_SeqList_ST25. txt，記錄日期： 2013年3月12日，文件大小329千字節）。 發明領域
[0005] 本發明總體上涉及免疫學、自身免疫、炎癥、傳染病和腫瘤免疫學領域。更具體地 說，本發明涉及包含免疫球蛋白Fc結構域和Fab結構域的生物學活性生物模擬分子、包含 這類生物模擬物的組合物和制備及使用這類生物模擬物的方法。
[0006] 發明背景
[0007] 單克隆抗體（mAb)療法是醫學中的一個重要且不斷增長的部分。無論在美國或是 歐洲，已批準超過30種單克隆抗體用于各種免疫疾病、傳染病和癌癥，且數百種正在研宄 中。然而，在單克隆抗體療法開發中的一個常見問題是盡管存在Fab和FcR結合但缺乏足 夠效力。因為通常有必要用高劑量以便實現療效，所以不利副作用往往與治療性抗體相關 聯。此外，腫瘤和其它靶抗原的低表達或改變的表達，以及影響抗體靶標或抗體結合的下游 效應的基因突變可致使抗體療法無效。作為一個實例，單克隆抗體曲妥珠單抗是特異性對 抗HER2/neu乳腺癌抗原的mAb，并且能以商品名Herceptin?'商購獲得，其已被美國食品和 藥物管理局批準用于治療乳腺癌。曲妥珠單抗可能在高度表達HER2/neu的患者中有效；然 而，大約90%的乳腺癌患者患有未被歸類為高度表達HER2/neu的腫瘤。作為另一個實例， 西妥昔單抗（特異性對抗表皮生長因子受體（EGFR)的mAb，并且能以商品名Erbitux?商 購獲得）已被美國食品和藥物管理局批準用于治療結腸癌。西妥昔單抗阻斷EGFR且阻止 下游KRAS蛋白依賴性腫瘤增生途徑。從臨床角度看，西妥昔單抗可以改良具有野生型（WT) KRAS腫瘤的患者的整體反應率以及無疾病進展存活期。不幸的是，30% -60%的結腸癌患 者的腫瘤具有密碼子12或13KRAS突變，且最近的臨床試驗表明，具有突變KRAS的患者未 受益于西妥昔單抗的治療（匯總于Allegra等，Journal of Clinical Oncology，2009年 4月20日；27(12) :2091-6)。因此，需要用于治療癌癥以及用于治療自身免疫性病癥和炎 性疾病的新的基于類抗體的治療劑。
[0008] 由抗體所致的免疫細胞且尤其是自然殺傷（NK)細胞上的Fc受體，特別是低親和 力受體，諸如Fc γ RIIIa的接合和聚集導致標靶腫瘤或細胞在被稱為抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)的過程中活化、脫粒和溶解。也可以通過以下方式殺傷腫瘤細胞和免疫系統所靶向 的其它細胞：通過補體依賴性細胞毒性（CDC)，其中抗體結合補體，從而導致細胞毒性；或 通過抗體與抗原在不存在NK細胞或補體的情況下直接結合所致的直接細胞毒性（DC);或 通過其它機制，諸如誘導細胞凋亡，或干擾細胞生長或過程。目前，現有技術中需要鑒別增 加 ADCC、CDC、DC和殺傷腫瘤細胞或其它細胞的其它機制的手段，由此增加 mAb療法的效力。 具體地說，當用于細胞殺傷的補體依賴性途徑是全功能途徑時，CDC可以是一種用于殺傷癌 細胞和其它靶細胞的有效方法。然而，由于細胞膜修復機制和諸如抑制補體途徑的CD59等 調節蛋白，許多細胞具有CDC抗性。例如，盡管B細胞淋巴瘤和白血病細胞上的CD20表達 水平較高，但至少部分是由于補體抑制機制，患有B細胞惡性腫瘤的許多患者對用抗CD20 單克隆抗體利妥昔單抗治療無反應或具有抗性（Harjunpaa等，Scand. J. Immunol, 200051 ; 634-641)。因此，特別需要能夠增加⑶C的分子。
[0009] 發明概述
[0010] 本發明涉及包含免疫球蛋白Fc結構域、Fab結構域和多聚化結構域的生物學活性 生物模擬分子；包含這類生物模擬物的組合物；和制備及使用這類生物模擬物的方法。這 些生物模擬物廣泛應用于治療癌癥、炎性、自身免疫性和傳染病病狀，其中單克隆抗體可用 于或已用于臨床應用中。與其Fab跟本發明的生物模擬物中所包含的Fab相同的mAb相比， 本發明的生物模擬物的優點是具有更有效的抗體介導的細胞毒性、補體介導的細胞毒性和 補體clq結合。與其Fab對相同抗原具有特異性的mAb相比，本發明的生物模擬物還具有 更有效的補體依賴性細胞毒性和直接細胞毒性的優點。
[0011] WO 2008/151088公開了優選在斯塔都聚體（Stradomer)的情況下使用包含與一 個或多個Fab結構域連接的兩個或更多個Fc結構域的生物模擬分子來治療病理學病狀，包 括癌癥、自身免疫疾病及其它炎性病狀和傳染病。W02008/151088通過引用整體并入本文。 WO 2008/151088中所公開的包含Fab的分子被稱為"斯塔都體（stradobody) "，且擁有單克 隆抗體的Fab部分的抗原結合性質和斯塔都聚體的Fc受體結合性質。因此，這些斯塔都體 同時結合、交聯并活化效應細胞上的多個Fcy受體，從而產生無法通過各個mAb或免疫球 蛋白Fc骨架與各個Fc γ受體結合而實現的親合力，即使經由Fc誘變、脫巖藻糖基化或能 提高各個mAb與各個Fcy受體之間的親和力的其它方法加以優化。效應細胞上的Fcy受 體的多價結合在低表位表達的環境中特別重要。低表位表達導致mAb Fab結合事件過于孤 立而不能在效應細胞上足夠鄰近處產生足夠密度的Fc-Fcy受體結合事件以引起效應細 胞上的低親和力Fcy受體的下游活化。然而，如本文所公開，除Fab和Fc結構域之外，包 括一個或多個多聚化結構域增強斯塔都體的Fc γ R結合活性，從而導致親合力的緩慢解離 特征以及抗體依賴性細胞毒性（ADCC)、補體介導的細胞毒性（CDC)、直接細胞毒性（DC)、強 補體clq結合和/或細胞毒性的其它機制。具體地說，多聚化結構域位于兩個Fc結構域之 間或本文所公開的斯塔都體中的Fc區的羧基端處。令人驚訝的是，包含兩個特定多聚化結 構域、異亮氨酸拉鏈和IgG2鉸鏈的斯塔都體產生特別強的多聚化、對抗靶細胞的高細胞毒 性和高的clq結合。
[0012] Nagashima 等(Journal of Bioscience and Bioengineering 111(4):391-6(2011)和 Molecular Immunology 45(10):2752-63(2008))描述了如 W02008/151088所預期的具有Fe結構域的串聯重復序列的連續斯塔都體，其產生的ADCC相 對于源自它們的親本單克隆抗體（即，包含相同的Fab區）有所增強。然而，由于多聚化結 構域，本發明的斯塔都體導致斯塔都體同源二聚體多聚化，當與諸如Nagashima和別處所 描述的那些非多聚復合物相比時，這繼而增加能夠同時結合Fc γ R的Fc結構域的數目且最 終產生非常優良的結合和細胞毒性。
[0013] 在一個方面，本發明涉及一種斯塔都體，其包含Fab結構域、一個或多個Fc結構域 和一個或多個多聚化結構域。在另一實施方案中，所述一個或多個多聚化結構域能夠使所 述斯塔都體多聚化。在一個實施方案中，所述一個或多個多聚化結構域中的至少一個分隔 兩個或更多個Fc結構域。在另一個實施方案中，所述一個或多個多聚化結構域中的至少一 個位于所述Fc區的羧基端。在一個優選實施方案中，一個或多個Fc結構域是IgGlFc結構 域。
[0014] 在一個實施方案中，本發明涉及一種斯塔都體，其包含Fab結構域、一個或多個Fc 結構域和一個或多個多聚化結構域，其中所述一個或多個多聚化結構域能夠使所述斯塔都 體多聚化。在另一個實施方案中，所述多聚化結構域獨立地選自異亮氨酸拉鏈、IgG2鉸鏈和 GPP重復序列。在另一個實施方案中，所述斯塔都體包含兩個多聚化結構域。在另一實施方 案中，所述兩個多聚化結構域獨立地選自異亮氨酸拉鏈、IgG2鉸鏈和GPP重復序列。在另 一實施方案中，所述兩個多聚化結構域是異亮氨酸拉鏈和IgG2鉸鏈。在另一實施方案中， 所述兩個多聚化結構域都是IgG2鉸鏈。在另一個實施方案中，所述兩個多聚化結構域都是 異亮氨酸拉鏈。在另一個實施方案中，所述斯塔都體包含三個多聚化結構域。在另一個實 施方案中，所述斯塔都體包含四個或更多個多聚化結構域。
[0015] 在一個實施方案中，本發明涉及一種斯塔都體，其包含Fab結構域、一個或多個Fc 結構域和一個或多個多聚化結構域，其中所述一個或多個多聚化結構域能夠使所述斯塔都 體多聚化，且其中所述一個或多個多聚化結構域中的至少一個是異亮氨酸拉鏈。在另一實 施方案中，所述至少一個異亮氨酸拉鏈是根據SEQ ID NO:32,且能夠使所述斯塔都體多聚 化。在另一個實施方案中，所述一個或多個多聚化結構域中的至少一個是IgG2鉸鏈結構 域。在另一實施方案中，所述至少一個IgG2鉸鏈結構域是根據SEQ ID NO: 3,且能夠使所 述斯塔都體多聚化。在另一個實施方案中，所述一個或多個多聚化結構域中的至少一個是 GPP結構域。在另一實施方案中，所述至少一個GPP結構域包含根據SEQ ID NO: 26的氨基 酸序列，且能夠使所述斯塔都體多聚化。
[0016] 在一個實施方案中，本發明涉及一種斯塔都體，其包含Fab結構域、一個或多個Fc 結構域和一個或多個多聚化結構域，其中所述一個或多個多聚化結構域能夠使所述斯塔都 體多聚化。在另一實施方案中，至少一個Fc結構域是IgGl Fc結構域，且所述至少一個Fc 結構域包含IgGl CH2和IgGl CH3。在另一實施方案中，所述Fc結構域包含IgGl鉸鏈、IgGl CH2和IgGl CH3。在另一個實施方案中，所述斯塔都體包含多于一個Fc結構域。在另一實 施方案中，所述多于一個Fc結構域各自為IgGl Fc結構域。在另一實施方案中，所述多于 一個Fc結構域各自為IgG3 Fc結構域。在另一實施方案中，所述多于一個Fc結構域各自 為IgG2 Fc結構域。在另一實施方案中，所述多于一個Fc結構域各自為IgG4 Fc結構域。 在另一實施方案中，所述多于一個Fc結構域由IgGl Fc結構域和IgG2 Fc結構域、IgG3 Fc 結構域或IgG4 Fe結構域構成。
[0017] 在一個實施方案中，本發明涉及一種斯塔都體，其中所述斯塔都體從氨基到羧基 末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、第一多聚化結構域、第二多聚化結構域和第二Fe結 構域。在另一實施方案中，所述Fe結構域中至少一個是IgGlFc結構域。在另一個實施方案 中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、IgG2鉸鏈、異亮氨酸 拉鏈和第二Fe結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結 構域、第一 Fe結構域、異亮氨酸拉鏈、IgG2鉸鏈和第二Fe結構域。在一個特別優選的實施 方案中，所述第一 Fe結構域、異亮氨酸拉鏈、IgG2鉸鏈和第二Fe結構域共同包含根據SEQ ID N0:69的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab 結構域、第一 Fe結構域、IgG2鉸鏈、第二IgG2鉸鏈和第二Fc。在另一個實施方案中，所述 斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、異亮氨酸拉鏈、第二異亮氨酸 拉鏈和第二Fe結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結 構域、第一 Fe結構域、異亮氨酸拉鏈和第二Fe結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都 體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、IgG2鉸鏈和第二Fe結構域。在另 一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、G4S結 構域、IgG2鉸鏈和第二Fe結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端 包含Fab結構域、第一 Fe結構域、IgG2鉸鏈、G4S結構域和第二Fe結構域。在另一個實施 方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、G4S結構域、異 亮氨酸拉鏈、第二Fe結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含 Fab結構域、第一 Fe結構域、異亮氨酸拉鏈、G4S結構域和第二Fe結構域。在另一個實施方 案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、GPP結構域和第二 Fe結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、GPP結構域、IgG2鉸鏈和第二Fe結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體 從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、IgG2鉸鏈、GPP結構域和第二Fe結構 域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構 域、GPP結構域、異亮氨酸拉鏈和第二Fe結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨 基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、異亮氨酸拉鏈、GPP結構域和第二Fe結構 域。熟練技術人員將認識到可以使用其它多聚化結構域代替此處描述的多聚化結構域。
[0018] 在另一實施方案中，所述第一 Fe結構域和所述第二Fe結構域是IgGlFc結構域。 在另一個實施方案中，至少一個IgGlFc結構域包含IgGlCH2和IgGlCH3。在另一實施方案 中，所述IgGlFc結構域還包含IgGl鉸鏈。
[0019] 在一個實施方案中，本發明涉及一種組合物，所述組合物包含多聚化斯塔都體，其 中所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、第一多聚化結構域、第 二多聚化結構域和第二Fe結構域。
[0020] 在一個實施方案中，本發明涉及一種斯塔都體，其中所述斯塔都體從氨基到羧基 末端包含Fab結構域、單一 Fe結構域、第一多聚化結構域和第二多聚化結構域。在另一實 施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、單一 Fe結構域、異亮氨酸拉鏈 和IgG2鉸鏈。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe 結構域、IgG2鉸鏈和異亮氨酸拉鏈。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末 端包含Fab結構域、Fe結構域和IgG2鉸鏈。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到 羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域、IgG2鉸鏈和第二IgG2鉸鏈。在另一個實施方案中， 所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域和異亮氨酸拉鏈。在另一個實 施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域、異亮氨酸拉鏈和第 二異亮氨酸拉鏈。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、 Fe結構域、G4S結構域和IgG2鉸鏈。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末 端包含Fab結構域、Fe結構域、IgG2鉸鏈和G4S結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都 體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域、G4S結構域和異亮氨酸拉鏈。在另一個 實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域、異亮氨酸拉鏈和 G4S結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結 構域、結構域連接和IgG2鉸鏈。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包 含Fab結構域、Fe結構域、結構域連接和異亮氨酸拉鏈。在另一個實施方案中，所述斯塔都 體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域、IgG2鉸鏈和結構域連接。在另一個實施 方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域、異亮氨酸拉鏈和結構 域連接。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構 域和GPP結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、 Fe結構域、GPP結構域和IgG2鉸鏈。在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末 端包含Fab結構域、Fe結構域、IgG2鉸鏈和GPP結構域。在另一個實施方案中，所述斯塔都 體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域、GPP結構域和異亮氨酸拉鏈。在另一個 實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域、異亮氨酸拉鏈和 GPP結構域。熟練技術人員將認識到可以使用其它多聚化結構域代替此處描述的多聚化結 構域。
[0021] 在另一實施方案中，所述Fe結構域是IgGlFc結構域。在另一實施方案中，所述 IgGlFc結構域包含IgGlCH2和IgGlCH3。在另一實施方案中，所述IgGlFc結構域還包含 IgGl鉸鏈。
[0022] 在一個實施方案中，本發明涉及一種組合物，所述組合物包含多聚化斯塔都體，其 中所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、Fe結構域、第一多聚化結構域和第二 多聚化結構域。
[0023] 在另一個實施方案中，所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab結構域、兩個或 更多個Fe結構域和一個或多個多聚化結構域。在另一實施方案中，所述Fe結構域是IgGlFc 結構域。
[0024] 在一個實施方案中，本發明涉及一種斯塔都體，其中所述斯塔都體從氨基到羧基 末端包含Fab結構域、第一 Fe結構域、一個或多個多聚化結構域和第二Fe結構域。在另 一個實施方案中，本發明涉及一種斯塔都體，其中所述斯塔都體從氨基到羧基末端包含Fab 結構域、第一 Fe結構域和一個或多個多聚化結構域。在另一實施方案中，所述斯塔都體還 在Fe區的C末端處包含一個或多個多聚化結構域。在另一實施方案中，所述Fe結構域中 的一個或多個是IgGlFc結構域。
[0025] 在一個實施方案中，本發明涉及一種斯塔都體，其包含Fab結構域、一個或多個Fe 結構域和一個或多個多聚化結構域，其中所述一個或多個多聚化結構域能夠使所述斯塔都 體多聚化，且其中所述Fab結構域對EGFR具有特異性。在一個實施方案中，所述Fab結構 域的氨基酸序列與SEQ ID NO:31具有至少80%同源性。在另一實施方案中，所述Fab結 構域的氨基酸序列與SEQ ID NO:31具有至少90%同源性。在另一實施方案中，所述Fab 結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO:31具有至少95%同源性。在另一實施方案中，所述Fab 結構域的氨基酸序列與SEQ ID NO:31具有至少99%同源性。在另一實施方案中，所述Fab 結構域的氨基酸序列是SEQ ID N0:31。在一些實施方案中，所述一個或多個Fe結構域是 IgGlFc結構