一種快速檢測和鑒定番茄斑萎病毒的分子生物學方法及其引物的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及到植物病毒的分子生物學檢測和鑒定技術領域，具體涉及番茄斑萎病毒的分子生物學檢測和鑒定的方法及其專用引物。
【背景技術】
[0002]番前斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus, TSWV)是一種危害農業生產的重要病毒，屬于布尼亞病毒科(Bunyaviridae)、番前斑萎病毒屬(Tospovirus)。該病毒粒子為球形病毒，直徑為80-120nm。其基因組有3個單鏈RNA分子構成:S RNA編碼核殼體蛋白(NP)和非結構蛋白(NSs) ；M RNA編碼了糖蛋白前體(G1G2)和非結構蛋白(NSm) ；L RNA編碼了依賴RNA的RNA多聚酶(RdRp)。
[0003]TSffV最早發現于澳大利亞，目前在歐洲、北美、南美、亞洲和大洋洲等多個國家和地區廣泛分布，熱帶、亞熱帶、溫帶地區均有發生。TSWV寄主范圍十分廣泛，可侵染100科1090種植物，重要的寄主植物有花生、辣椒、煙草等，能引起許多重要的園藝植物和農作物的嚴重病害，甚至絕產，造成嚴重的經濟損失，是世界十大農業病害之一。1989年TSWV病毒被歐洲及地中海植物保護組織(European and Mediterranean Plant Protect1nOrganizat1n, ΕΡΡ0)列入A2類檢疫性有害生物。2006年中國將TSWV列入新公布的全國農業植物檢疫性有害生物名單中。
[0004]目前，血清學技術、電鏡技術、生物學測定和分子生物學技術被廣泛應用于番茄斑萎病毒屬病毒檢測和鑒定中。
[0005]血清學檢測技術是一種快速、靈敏度高，廣泛應用于病毒檢測和病害診斷的現代技術。也是目前用于檢測Tospovirus屬病毒常用的方法。1986年，Gonsalves和Trujillo開發的酶聯免疫反應(ELISA)是Tospovirus屬病毒檢測和診斷的重要轉折點。隨著酶聯免疫反應技術的發展高質量的多抗血清一一雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)和三抗夾心ELISA陸續用來對Tospovirus屬病毒檢測。1990年Wang等利用DAS-ELISA成功檢測到了TSWV病毒；1996年Roggero等應用TAS-ELISA在媒介昆蟲西花薊馬上，檢測到Tospovirus屬病毒。酶聯免疫反應檢測快速、靈敏度高，但是受到了病毒種類、檢測病毒是否單一、抗病毒血清、酶標血清和酶底物等的種類、來源、和組合等因素的影響。而且，同屬病毒出現交叉反應，限制了該技術對確定種鑒定的應用。
[0006]電鏡技術的優點是快速、簡單和直接。通過電鏡觀察可以確定病毒形態、大小、結構、內含體組成和亞結構，判斷病毒是否存在。Tospovirus屬病毒粒子為具有包膜的球狀病毒，病毒粒子的直徑為80-120nm，通過電鏡觀察，依據病毒粒子的形狀和大小可以判斷到科或屬，但不能確定種，不能準確鑒定TSWV病毒。
[0007]傳統生物學測定，一方面可以通過摩擦接種等方法獲得病毒寄主范圍特征，也可以通過其他傳統方法確定病毒傳播途徑、介體的種類、病毒寄主范圍、體外保毒期、稀釋限點以及與已知病毒的交叉保護作用和細胞質內含體形態等其他生物學指標。但是傳統生物學測定不能準確檢測和鑒定TSWV病毒，且耗時較長，不能滿足生產及檢疫部門快速檢測的需要。另外，不同病毒在同種植物上產生的癥狀有相似性；同種病毒的不同株系可產生不同癥狀、復合侵染及病毒衛星RNA會影響癥狀表現、病毒常會產生潛隱侵染、不同土壤和氣候條件可改變癥狀表現等，使傳統生物學測定不能準確檢測和鑒定TSWV病毒。
[0008]目前，分子生物學檢測技術中利用PCR(聚合酶鏈反應，Polymerase ChainRe-act1n 簡稱 PCR)和 RT-PCR(反轉錄聚合酶鏈反應，reverse transcript1n-PCR,簡稱RT-PCR)方法檢測植物病毒應用非常廣泛。1996年，Weekes等成功地用RT-PCR檢測到Tospovirus屬病毒，以后對該方法又作了一些修改。2001年Cortez等又對該技術作了修改，使檢測更加靈敏、可靠。2003年G1vanna等成功地用RT-PCR檢測到單頭薊馬體內的TSWV。但是，現在所用的特異性引物主要是依據N基因序列或其他單基因，或其他單條RNA序列所設計的，應用該類引物的RT-PCR檢測技術，會出現假陽性的結果，因此不能通過擴增產物的片段大小來判斷結果，還需要進行克隆和測序，以及序列的比對，才能取得準確結果O
[0009]此外，為了精確地定量檢測基因數量，1993年，Higuchi首次報道了實時PCR(Realtime-PCR)方法。1996年由美國Applied B1systems公司推出實時焚光定量PCR技術，2000年，Cassie等報道了應用實時熒光定量PCR技術定量檢測TSWV病毒。但該方法成本較高，不適合一般定性檢測鑒定。
【發明內容】
[0010]本發明要解決的技術問題是克服現有RT-PCR檢測技術依據基因、列序列設計引物，可能出現的假陽性的缺陷，以及克隆、測序和序列比對的耗時、耗力，實時熒光定量PCR技術昂貴的缺陷，其目的是提供一種具有快速、準確，可靠和特異性強的特點的檢測和鑒定番茄斑萎病毒的分子生物學方法及其專用引物。
[0011]為解決上述技術問題和實現本發明目的，本發明采用的技術方案如下:
[0012]1、一種快速檢測和鑒定番茄斑萎斑病毒的專用引物L3，該專用引物L3是由前引物和后引物組成，所述專用引物L3的前引物堿基序列如序列表中SEQ ID N0:1所示，所述專用引物L3的后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，目標產物片段長度為605bpo
[0013]2、一種快速檢測和鑒定番茄斑萎斑病毒的專用引物M3，該專用引物M3是由前引物和后引物組成，所述專用引物M3的前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID N0:3所示，所述專用引物M3的后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，目標產物片段長度為794bp0
[0014]3、一種快速檢測和鑒定番茄斑萎病毒的專用引物S4，所述的專用引物S4是由前引物和后引物組成，所述專用引物S4的前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID N0:5所示，所述專用引物S4的后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，目標產物片段長度為1277bp0
[0015]4、一種快速檢測和鑒定番前斑萎斑病毒的分子生物學方法，包括提取感病植物樣品的總RNA，RT-PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，克隆，測序和序列比對；在進行RT-PCR擴增中所用的引物是技術方案I所述的專用引物L3。
[0016]5、一種快速檢測和鑒定番茄斑萎病毒的分子生物學方法，包括提取感病植物樣品的總RNA，RT-PCR擴增，用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，克隆，測序和序列比對；在RT-PCR擴增中所用的引物是技術方案2所述的專用引物M3。
[0017]6、一種快速檢測和鑒定番茄斑萎病毒的分子生物學方法，包括提取感病植物樣品的總RNA，RT-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，克隆，測序和序列比對；:在進行RT-PCR擴增中所用的引物是技術方案3所述的專用引物S4。
[0018]7、一種快速檢測和鑒定番茄斑萎病毒的分子生物學方法，由提取感病植物樣品的總RNA，RT-PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳3部分構成組成，將提取的感病植物樣品的總RNA，分別用技術方案I所述的專用引物L3、技術方案2所述的專用引物M3和技術方案3所述的專用引物S4進行RT-PCR擴增，在RT-PCR反應終止后，分別取3 μ I PCR產物，分別用瓊脂糖電泳檢測擴增，分別得到L3的擴增片段為605bp、M3的擴增片段為794bp和S4的擴增片段為1277bp，則該植物樣品為番茄斑萎病毒所侵染，不需要再進行克隆、測序和序列比對。
[0019]8.快速檢測和鑒定番茄斑萎病毒的一組專用引物，所述的一組專用引物由專用引物L3、專用引物M3和專用引物S4組成，所述專用引物L3由前引物和后引物組成，專用引物L3的如引物的喊基序列如序列表中SEQ ID NO:1所不，專用引物L3的后引物的喊基序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，目標產物長度為605bp ;所述專用引物M3由前引物和后引物組成，專用引物M3的前引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:3所示，專用引物M3的后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:4所示，目標產物長度為794bp ;所述專用引物S4由如引物和后引物組成，專用引物S4的肖U引物的喊基序列如序列表中SEQ ID NO:5所不，專用引物S4的后引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO:6所示，目標產物長度為1277bp。
[0020]本發明具有以下技術優勢:
[0021]1、本發明根據病毒基因組中L、M、S RNA的保守序列分別設計3對特異性引物，用其中任何一對引物進行RT-PCR擴增，得到目標產物片段長度為預期值時，測序后加上序列比對，就能夠準確檢測和鑒定番茄斑萎病毒；本發明此方法具有準確，可靠，特異性強的特點，而且不受寄主植物的影響，能有效地排除假陽性，適用的植物寄主檢測范圍廣。
[0022]2、與前人RT-PCR檢測技術比較，所設計的三對引物分別取自病毒基因組中L、M、S RNA的保守序列，如果通過這3對引物分別進行RT-PCR擴增分別可以得到L RNA (片段長度:605bp)、M RNA(片段長度:794bp)、S RNA(片段長度:1277bp)，與預測片段一致的PCR產物，不需要再進行測序，就可以確定該樣品為番茄斑萎病毒所侵染，本發明此方法不僅具有準確，可靠，特異性強的特點，不受寄主植物的影響，能有效地排除假陽性，適用的植物寄主檢測范圍廣，而且，可以大大縮短檢測耗時，省時、省力。整個檢測過程5.5h(RNA提取2.5h+RT40min+PCR Ih 50min+電泳0.5h)，而前人的RT-PCR技術進行測序和序列比對，還需要至少I天以上的時間。
[0023]3、