一種預示和鑒定西瓜果肉顏色的分子標記KpnI-1及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種預示和鑒定西瓜果肉顏色的分子標記KpnI-1及應用，屬于分子 生物學技術領域。
【背景技術】
[0002] 分子標記輔助選擇是隨著現代分子生物學技術的迅速發展而產生的新技術，它可 以從分子水平上快速準確地分析個體的遺傳組成，從而實現對基因型的直接選擇，進行分 子育種。分子標記輔助選擇成功的關鍵在于所獲得的分子標記是否與待分析的性狀相連鎖 以及是否在同一物種的不同材料間具有通用性。
[0003] 西瓜的果肉顏色是西瓜品質構成的一項重要指標，西瓜果實中含有番茄紅 素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質等多種色素，不同色素的組成及含量的多少使西 瓜果肉呈現出不同顏色。同時，西瓜果肉中的色素也具有對人體有益的生理功能， 有研宄表明，番茄紅素具有高效的抗氧化活性，能有效的降低癌癥和心腦血管的發 病率，并可以作為一種功能性色素廣泛的應用于功能食品、藥品和化妝品中（Sahin K,TuzcuM,SahinN,etal.Nrf2/H〇-lsignalingpathwaymaybetheprimetarget forchemopreventionofcisplatin-inducednephrotoxicitybylycopene.Food ChemToxicol, 2010, 48(10):2670-2674；MortensenA,SkibstedLH,SampsonJ,et al.Comparativemechanismsandratesoffreeradicalscavengingbycarotenoid antioxidants.FEBSLett, 1997,418(12):91-97)。0-胡蘿卜素可以減少脂質過氧化保護 有機體不被破壞（OlsonJA.Molecularactionsofcarotenoids.In:CanfieldLM(ed). CarotenoidsinHumanHealth,NewYork.AcademyofSciences, 1993. 156-166)，葉黃素 對維護視力有著重要的作用。因此通過分子標記輔助選擇的方法高效的選育不同果肉顏色 的西瓜品種是當前西瓜育種工作的主要部分。
[0004] 隨著DNA分子標記技術的快速發展，利用與植物相關基因緊密連鎖的分子標記進 行輔助選擇，可以極大的加速主要性狀的篩選和基因定位，從而大大提高育種選擇效率。但 是，西瓜的遺傳距離較為狹窄，目前文獻已公布的可用的分子標記數目較少且多態性較低， 嚴重制約了西瓜主要農藝性狀基因定位及相關分子標記的開發。
【發明內容】
[0005] 為提供一個CAPS分子標記，用以對含有番前紅素和不含有番前紅素的西瓜植株 進行分子標記輔助選擇，本發明采取了以下技術方案：
[0006] 本發明的一個目的在于提供一種預示和鑒定西瓜果肉顏色的分子標記KpnI-1，通 過該分子標記擴增出的PCR產物片段大小為517bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。
[0007] 所述標記位于西瓜番茄紅素環化酶cds區段，該區段的GenBank登錄號為 ABM90917. 1，與西瓜番茄紅素0-環化酶基因緊密連鎖。
[0008] 所述標記的鑒別引物對正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，反向引物的 核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0009] 所述分子標記KpnI-1應用于鑒定和輔助篩選西瓜的果肉顏色。
[0010] 所述應用是提取待測樣品的DNA后，利用鑒別引物對進行PCR擴增，再利用限制性 內切酶對擴增產物進行酶切，最后利用電泳對酶切產物進行檢測。
[0011] 所述應用的步驟如下：
[0012] 1)提取待測樣品的DNA ;
[0013] 2)以待測樣品的DNA為模板，利用鑒別引物對進行PCR擴增，獲得擴增產物；
[0014] 3)利用限制性內切酶對步驟2)所得的擴增產物進行酶切，獲得酶切產物；
[0015] 4)利用瓊脂糖凝膠電泳對步驟3)所得的酶切產物進行檢測。
[0016] 步驟2)所述鑒別引物對，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，反向引物 的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0017] 優選地，步驟2)所述PCR擴增，采用降落PCR，擴增程序為：94°C預變性7min，94°C 變性30s，60 °C退火30s，每循環降低0. 5 °C，72 °C延伸40s，30個循環；94°C變性30s，45 °C退 火30s，72°C延伸40s，10個循環；72°C延伸10min，4°C保存。
[0018] 優選地，步驟4)所述對酶切產物進行檢測，是利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切后 的產物條帶是否為517bp，含有517bp條帶的樣品含有番茄紅素，果肉顏色為紅色；不含有 517bp條帶的樣品不含有番茄紅素，果肉顏色為黃色。
[0019] 本發明的另一目的在于提供一種所述分子標記KpnI-1的獲得方法，該方法的步 驟如下：
[0020] 1)選擇一個淺黃色西瓜品系和一個紅色西瓜品系；
[0021] 2)利用高通量測序技術對步驟1)所選的兩個品系的西瓜進行測序，并將所得 序列與西瓜番茄紅素環化酶基因cds區段的序列進行比對，獲得存在西瓜番茄紅素 0-環化酶基因cds區段的序列的染色體區間；
[0022] 3)在步驟2)所得染色體區間內查找存在SNP突變的堿基區段，并分析SNP位點的 酶切信息，獲得存在CAPS突變的序列；
[0023] 4)針對步驟3)所得的序列，設計引物；
[0024] 5)利用步驟4)所得的引物以西瓜基因組DNA為模板進行TD-PCR擴增，獲得擴增 產物；
[0025] 6)利用限制性內切酶對步驟5)所得的擴增產物進行酶切驗證。
[0026] 本發明利用CAPS分子標記引物通過PCR擴增獲得與西瓜果肉顏色相關的DNA片 段，再利用限制性內切酶對獲得的片段進行酶切反應，由于兩種不同顏色的西瓜材料在所 獲得的DNA片段中存在酶切位點的單堿基突變的差異。因此，存在單堿基突變的位點不會 被限制性內切酶切開而獲得一條大小為517bp的片段，不存在堿基突變位點的片段會被限 制性內切酶切開，獲得389bp及128bp的兩個片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可以清晰的將兩中 不同果肉顏色的西瓜材料進行區分。
[0027] 本發明獲得的CAPS分子標記，在不同的果肉顏色的西瓜材料中可以進行很好的 區分，通過對分子標記所在染色體附近序列進行Blast比對的結果可知，該標記與西瓜番 茄紅素0_環化酶緊密連鎖，因此，本發明獲得了一個可以高效區分不同西瓜果肉番茄紅 色有無的分子標記，為今后西瓜番茄紅素相關主效基因的定位奠定基礎。
[0028] 本發明獲得的有益效果如下：
[0029]CAPS分子標記是以酶切位點單堿基突變產生多態性的分子標記，以其分布范圍廣 泛、變異穩定成為基因定