一種與西瓜果肉顏色相關的分子標記MluI-6的篩選方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種與西瓜果肉顏色相關的分子標記MluI-6的篩選方法及應用，屬 于分子標記輔助育種技術領域。
【背景技術】
[0002] 分子標記輔助選擇是隨著現代分子生物學技術的迅速發展而產生的新技術，它可 以從分子水平上快速準確地分析個體的遺傳組成，從而實現對基因型的直接選擇，進行分 子育種。分子標記輔助選擇成功的關鍵在于所獲得的分子標記是否與待分析的性狀相連鎖 以及是否在同一物種的不同材料間具有通用性。
[0003] 西瓜的果肉顏色是西瓜品質構成的一項重要指標，西瓜果實中含有番茄紅 素、胡蘿卜素、葉黃素、玉米黃質等多種色素，不同色素的組成及含量的多少使西 瓜果肉呈現出不同顏色。同時，西瓜果肉中的色素也具有對人體有益的生理功能， 有研宄表明，番茄紅素具有高效的抗氧化活性，能有效的降低癌癥和心腦血管的發 病率，并可以作為一種功能性色素廣泛的應用于功能食品、藥品和化妝品中（Sahin K,Tuzcu M, Sahin N, et al. Nrf2/H〇-lsignaling pathway may be the prime target for chemoprevention of cisplatin-induced nephrotoxicity by lycopene. Food Chem Toxicol, 2010, 48(10):2670-2674 ；Mortensen A,Skibsted L H, Sampson J, et al.Comparative mechanisms and rates of free radical scavenging by carotenoid antioxidants.FEBS Lett, 1997,418(12):91-97)。0-胡蘿卜素可以減少脂質過氧化保護 有機體不被破壞（Olson J A. Molecular actions of carotenoids. In:Canfield LM(ed). Carotenoids in Human Health, New Y ork. Academy of Sciences, 1993. 156-166)，葉黃素 對維護視力有著重要的作用。因此通過分子標記輔助選擇的方法高效的選育不同果肉顏色 的西瓜品種是當前西瓜育種工作的主要部分。
[0004] 隨著DNA分子標記技術的快速發展，利用與植物相關基因緊密連鎖的分子標記進 行輔助選擇，可以極大的加速主要性狀的篩選和基因定位，從而大大提高育種選擇效率。但 是，西瓜的遺傳距離較為狹窄，目前文獻已公布的可用的分子標記數目較少且多態性較低， 嚴重制約了西瓜主要農藝性狀基因定位及相關分子標記的開發。近年來，高通量測序技術 迅猛發展，通過測序技術獲得的西瓜基因組數據為西瓜主要性狀的基因定位及大量分子標 記的開發提供了新的途徑。開發大量的與西瓜主要農藝性狀相關的分子標記可以為西瓜育 種工作在基因層面上提供強有力的理論依據，快速、高效的服務于傳統育種工作。
[0005] CAPS分子標記是以酶切位點單堿基突變產生多態性的分子標記，以其分布范圍廣 泛、變異穩定成為基因定位及分子生物學研宄的新一代標記，CAPS標記操作簡便，結果易于 觀測且在相同物種間具有普遍適用性。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種與西瓜果肉顏色相關的分子標記MluI-6的篩選方法及應用， 用以對含有番茄紅素和不含有番茄紅素的西瓜植株進行分子標記輔助選擇，采用的技術方 案如下：
[0007] 本發明的目的在于提供一種與西瓜果肉顏色相關的分子標記MluI-6的篩選方 法，該方法是對不同果肉顏色品系的西瓜進行測序，再將所得序列與西瓜果肉顏色相關的 基因序列進行比對分析后，獲得與西瓜果肉顏色相關的基因序列所在的染色體區間，在染 色體區間內篩選出存在CAPS突變的序列，根據突變序列設計CAPS分子標記引物，再利用 CAPS分子標記引物及西瓜基因組DNA進行PCR擴增，最后對擴增產物酶切后利用電泳進行 驗證。
[0008] 所述方法步驟如下：
[0009] 1)選取兩種不同果肉顏色品系的西瓜；
[0010] 2)利用高通量測序技術測定步驟1)所選的兩種西瓜的基因序列，將所得序列與 西瓜果肉顏色相關的基因序列進行比對分析，獲得存在與西瓜果肉顏色相關的基因序列所 在的染色體區間，在該區間內篩選測序序列存在SNP突變位點的堿基區段，分析SNP位點的 酶切信息，獲得存在CAPS突變的序列；
[0011] 3)針對步驟2)所得的序列，設計CAPS分子標記引物；
[0012] 4)以西瓜基因組DNA為模板，利用步驟3)所得的CAPS分子標記引物進行PCR擴 增反應，獲得PCR產物；
[0013] 5)利用限制性內切酶對步驟4)所獲得的PCR產物進行酶切反應；
[0014] 6)利用瓊脂糖凝膠電泳對步驟5)所獲得的酶切產物進行驗證。
[0015] 步驟1)所述兩種不同果肉顏色的西瓜品系，一種為黃色，另一種為紅色。
[0016] 步驟1)所述與西瓜果肉顏色相關的基因序列，位于西瓜番茄紅素環化酶基因 的cds區段，該區段的GenBank登錄號為ABM90917. 1，其與西瓜番茄紅素0 -環化酶基因緊 密連鎖。
[0017] 步驟3)所述CAPS分子標記引物，正向引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，反向 引物核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0018] 步驟4)所述PCR產物，片段大小為566bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0019] 步驟5)所述PCR擴增，采用TD-PCR，程序為：94°C預變性7min，94°C變性30s，60°C 退火30s，每循環降低0. 5°C，72°C延伸40s，30個循環；94°C變性30s，45°C退火30s，72°C延 伸9〇8，10個循環；721：延伸1〇111111，41：保存。
[0020] 步驟6)所述驗證，酶切產物條帶為566bp-種片段，西瓜果肉中含有番茄紅素；酶 切產物條帶為287bp和279bp兩種片段，西瓜果肉中不含番茄紅素。
[0021] 所述方法具體步驟為：
[0022] 1)選擇一個淺黃色西瓜品系和一個紅色西瓜品系；
[0023] 2)利用高通量測序技術對步驟1)所選的兩種西瓜品系進行測序，將所得序列與 從NCBI網站上獲得的西瓜番茄紅素0 -環化酶基因的cds區段的序列進行比對，得到存在 西瓜番茄紅素0 _環化酶基因的cds區段的序列的染色體區間，在該區間篩選測序數據存 在SNP突變位點的堿基區段，分析SNP位點的酶切信息，獲得存在CAPS突變的序列；
[0024] 所述CAPS突變序列如SEQIDNO. 3所示；
[0025] 3)針對步驟2)所得的序列，設計CAPS分子標記引物；
[0026] 所述CAPS分子標記引物，正向引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，反向引物核 苷酸序列如SEQIDNO. 2所示；
[0027] 4)以西瓜基因組DNA為模板，利用步驟3)所得的CAPS分子標記引物進行TD-PCR 擴增反應，獲得PCR產物；所述PCR產物，片段大小為566bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 3所 示；
[0028] 5)利用限制性內切酶對步驟4)所獲得的PCR產物進行酶切反應；
[0029] 6)利用瓊脂糖凝膠電泳對步驟5)所獲得的酶切產物進行驗證。
[0030] 本發明方法用于鑒定和輔助篩選西瓜的果肉顏色。
[0031] 本發明利用CAPS分子標記引物通過PCR擴增獲得與西瓜果肉顏色相關的DNA片 段，再利用限制性內切酶對獲得的片段進行酶切反應，由于兩種不同顏色的西瓜材料在所 獲得的DNA片段中存在酶切位點的單堿基突變的差異。因此，存在單堿基突變的位點不會 被限制性內切酶切開而獲得一條大小為566bp的片段，不存在堿基突變位點的片段會被限 制性內切酶切開，獲得287bp及279bp的兩個片段，通過瓊脂糖凝膠電泳可以清晰的將兩中 不同果肉顏色的西瓜材料進行區分。
[0032] 本發明的分子標記MluI-6是首次發現，在現有技術中并沒有被發現也沒有被命 名。本發明克服了以下技術難度：首先，西瓜的遺傳基礎較為狹窄，目前已公布可利用的分 子標記數量有限且在不同材料間的多態性極低。其次，目前已公布的大多數分子標記位于 基因的非編碼區，很難將這些標記與相關性狀緊密結合，因此能用于對西瓜果肉顏色進行 基因定位和分子標記輔助選擇的分子標記少之又少。最后，本發明在基因組重測序數據的 基礎上開發了大量的CAPS分子標記，通過大量的田間性狀調查和基因定位等分子標記試 驗獲得了可以對西瓜果肉顏色進行區分的CAPS分子標記。
[0033] 本發明有益效果：
[0034] 1)本發明根據高通量測序所得到的西瓜基因組數據，設計并開發了與西瓜果肉顏 色相關的CAPS分子標記。所開發CAPS分子標記在不同材料中具有通用性，操作簡便結果 明確。通過分子標記輔助選擇的方法，在西