老年性癡呆病變前期PS-1基因的mRNA水平原位雜交篩查試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測領域，更具體地說，是涉及與老年性癡呆（AD)病變前期mRNA 表達改變（病理演變過程）的相關檢測技術。
【背景技術】
[0002] 阿爾茨海默病（Alzheimer' s disease-, AD)是最常見的癡呆類型，占所有癡呆 的609T80%，也是致殘率高和負擔大的疾病之一。到2006年，人類第一殺手心臟病死亡率 比2000年下降了 11. 5%，第二殺手卒中死亡率下降了 18. 1%，但阿爾茨海默病的死亡率卻上 升了 47. 1%，成為老年人的第5位致死原因。隨著全球性人口規模和預期壽命的增加，阿爾 茨海默病已成為世界衛生問題，根據未來的預測，癡呆患病率每二十年增加近一倍，至2030 年將達到6570萬，到2050年將達到1億1540萬。各國阿爾茨海默病患者數增加不是均衡 的。發達國家的癡呆人數預測以100%的比例增長，而中國/印度及其南亞和西太平洋鄰國 等發展中國家將以超過300%的比例增長，中國的AD人數則將以336%的比例增長。中國是 世界上人口老化基數最大國家，截止2008年底，我國60歲以上老年人口已接近1. 69億，占 總人口的12%。根據2005年北京協和醫院領導的一項跨省市(北京/上海/成都/西安)流 行病學調查結果估計，65歲以上老年人AD患病率為4.8%，且隨著年齡增長而增加。因此， 中國絕不是一個AD低發國家，恰恰相反，而是世界上AD人數最多且增長速度最快的國家。 因此迅猛增加的疾病負擔必將對我國的社會經濟發展和家庭生活產生重要影響。
[0003]AD是世界上致殘率高且負擔重的疾病。按照2003年度世界衛生組織報導的關于 全球疾病負擔的估計，60歲以上老年人中癡呆導致殘疾的占11. 2%，遠高于卒中（9. 5%)、骨 骼肌障礙（8. 9%)、心血管病（5%)及各種類型的癌癥（2. 4%)。據美國一個跨學科專家組的共 識估計，除脊髓損傷和晚期癌癥以外，AD致殘加權顯著高于任何其他健康狀況。在美國，AD 人口已超過500萬，AD的花費已超過1000億美元，估計到2050年AD患者人數將以幾何級 數方式增長到1300萬人，經過核算，每年將花費1400億美元。AD已成為重大的公共衛生 問題，并確定為未來幾年公共衛生問題的研究重點。
[0004] AD是一種常見的神經系統退行性疾病，臨床表現為進行性認知功能減退，典型 病理改變為老年斑（sen ile plaque, SP)、神經原纖維纏結（neurona 1 fibrillary tang les, NFT)及神經元丟失，另外伴有顆粒空泡變性（granulov acuolar degeneration,⑶)，平野小體和腦血管的改變。經過數十年有關AD的病因和發病機制的 研究后，雖然對AD的病因還有許多不了解，但是對其病理和生理機制有了肯定和全面的認 識，并從中發現了一些重要的疾病標志。現代分子遺傳學在幫助人類認識AD的發病機制方 面意義非凡，發現常染色體突變能導致A 0 42肽的表達增多。這些基因包括與早發型阿爾 茨海默病相關的21號染色體上的淀粉樣前體蛋白（APP)、14號染色體上的早老素1 (PS1) 和1號染色體上的早老素2(PS2)的突變，疾病標志還包括以及晚發型阿爾茨海默病相關的 19好染色體上的載脂蛋白E(APOE)和新近發現的10號染色體突變。通過正電子發射斷層 成像（PET)顯像的淀粉樣肽(A3 )或腦脊液（CSF)A3水平；通過氟脫氧葡萄糖-PET及 功能磁共振顯示的突出異常；CSF中磷酸化微管相關蛋白（p-tau)水平及MRI體積所反映的 神經元脫失。AD的生物標志物能很好地幫助臨床診斷，與病理發現有良好的一致性。2010 年美國國立老化研究院和阿爾茨海默病聯合會推薦新的診斷定義與標準，強調將記憶損害 與生物標志物結合。AD是疾病的整個臨床過程，包括了AD癡呆前期和癡呆期AD。AD的臨 床前驅期則指出現早期病理生理學改變至出現最早的認知癥狀之間漫長的階段。
[0005] 當前，臨床使用的AD治療藥物不少，但均缺乏有臨床意義的療效。癡呆是嚴重的 認知功能損害，呈進展性和不可逆性，要通過藥物干預實現病情穩定或緩解是極其困難的。 因此，對癡呆實施預防應該是一個重要的臨床研究方向。最新AD研究報告表明，作為"嬰 兒"這一代，到2050年在美國將有1千3百50萬人成為AD癡呆患者。如果，假設有一種干 預可以是AD癡呆的發病延遲5-10年或提早5-10預測和篩查，那么AD癡呆患者人數將減 少80%，用于AD的預計醫療費用將會大大減少。因此，尋找有效AD篩查工具，對臨床前期AD 患者及未發生AD高危人群的早期篩查，在人群中盡早開展干預治療，減少AD的最終發生率 有重要的臨床和時代意義。盡早開發出應用于AD病變前期mRNA水平篩查試劑盒，這將改 變目前臨床上的AD發生后的診治模式，將AD的診治提高、提前到病變前期，做到預防性(治 未病）的早期介入和治療，并進一步做到mRNA水平的調控及基因早期治療，將AD消滅在萌 芽狀態。
[0006] 本發明人在長期研究中發現，導致老年性癡呆治療效果不佳的主要原因是不能做 到真正的早期診斷。本課題擬采用核酸原位雜交技術，尋找與AD發病密切相關的PS-1基因 一級轉錄功能產物-mRNA，觀察其在AD病人、高危人群、正常對照人群表達變化，統計分析 其臨床應用意義和價值，并培養、開發出可應用于臨床的早期篩查試劑盒，用于臨床前期AD 患者及高危人群的早期篩查，做到預防性診治，盡早開展干預治療，減少AD的最終發生率。
[0007] 隨著分子生物技術日益完善，功能基因組學，疾病基因組學等研究的深入展開，為 了尋求更早期的篩查和治療老年性癡呆、以及預防老年性癡呆，已取得長足進步。至今，我 們已有可能在基因的一級轉錄功能產物（mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在老年 性癡呆癥的基因生理病理學演變前期，就可以做到早期預測和篩查。本發明采用核酸原位 雜交技術，選擇多組臨床標本(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照)，對PS-1基因與老年 性癡呆癥的早期預警進行檢測分析。
[0008]PS-1基因的mRNA作為早期篩查老年性癡呆病變前期有非常重要的臨床診斷意 義。PS-1基因的mRNA在老年性癡呆癥前期及病變過程中表達過度。它作于老年性癡呆病 變前期篩查、及老年性癡呆癥早期預防的檢測指標及治療后的復發預警也有非常重要的臨 床意義。
[0009]發明人在長期的研究中，得出了一種新理念，臨床的重大疾病的臨床診治模式一 定要改變，不能只停留現在治已病（發病后診治)，要做到預防性診治，做到治已病，只有這 樣才能降低重大疾病的發病率和死亡率，降低社會成本和醫療成本。因此，發明人在開發和 生產重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術上都做了大膽創新。特 別是篩選臨床標本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常組織與疾病組織比較的一 貫性研發思路，來尋找和開發病變期前mRNA水平，與疾病早期基因病理生理學演變密切相 關，而且臨床意義非常重要靶標，將臨床上疾病形成后診治模式變成疾病的預防性診治，爭 取了疾病診治的時間和空間，達到預防重大疾病。
[0010] 根據現有的文獻資料PS-1基因mRNA水平的檢測技術及試劑盒未見報道。
[0011] 本發明人在對(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照人）例組，用原位雜交技術 進行檢測，結果表明以上老年性癡呆癥PS-1基因都過度表達，高危人群有不同程度表達 15-25%，正常人都是零表達。表明PS-1基因是老年性癡呆病變前期篩查的重要標志物。
[0012] 原位雜交技術（insituhybridiz