一種原位調節細菌纖維素結構的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種原位調節細菌纖維素結構的方法，屬于生物材料制備領域。
【背景技術】
[0002]細菌纖維素(BacterialCellulose，簡稱 BC)是以木醋桿菌(AcetobacterxyIinum)為代表的少數微生物合成分泌的一種胞外多糖，是一種天然形成的最細的纖維。由于其純度高、結晶度高、持水量高、良好的三維結構、良好的生物相容性，使BC廣泛用于制備生物醫用材料，如慢性創傷敷料、種植牙、可再生軟組織支架等，目前很多技術已實現商品化，使BC成為具有廣闊應用前景的生物功能材料。
[0003]但對于一些特殊的醫用材料，如植入式支架，用于BC表面纖維網絡過于致密，細胞難以滲入材料中，細胞滲透進入支架的深度直接影響了組織的生長成形。目前已有文獻報道(1Yin N, Stilwell M D, Santos TMA, et al.Agarose particle-templatedporous bacterial cellulose and its applicat1n in cartilage growth in vitr0.Acta b1materialia, 2015, 12:129-138.2Uraki Y, Nemoto J, Otsuka H, TamaiY, Sugiyama J, Kishimoto T, et al.Honeycomb-like architecture produced byliving bacteria Gluconacetobacter xylinus.Carbohydrate Polymers, 2007,69:1-6.3Zaborowska M, Bodin A, Backdahl H, Popp J, Goldstein A, Gatenholm P.Microporous bacterial cellulose as a potential scaffold for bone regenerat1n.Acta B1mater 2010;6:2540 - 7.)改變細菌纖維素孔結構的方法，但現有方法存在一定的缺陷，如:
1、發酵過程中加入固體石蠟，但固體石蠟不易去除，同時反復沖洗會破壞BC的三維結構；
2、發酵過程中加入淀粉顆粒，但淀粉顆粒會沉降在培養皿底部，不能被纖維素微纖絲包埋。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種原位調節細菌纖維素結構的方法。
[0005]本發明的原理是:通過在發酵培養基中添加羧甲基纖維素鈉及碳酸鈣，碳酸鈣是一種常見的無機化合物，幾乎不溶于水，培養基含一定濃度的羧甲基纖維素鈉能使碳酸鈣在實驗過程中保持懸浮狀態，木醋桿菌在合成纖維素的過程中，將碳酸鈣顆粒包裹進纖維素網絡結構中，能較好地擴大BC的孔大小。同時木醋桿菌在發酵過程中會分泌酸性物質，使發酵環境PH下降，碳酸鈣能與這類物質發生反應，維持發酵過程pH相對穩定，有利于代謝產物的積累。
[0006]實現本發明目的的技術解決方案為:一種原位調節細菌纖維素結構的方法，包括如下步驟:
第一步:木醋桿菌進行種子擴增培養； 第二步:發酵液中加入一定濃度的羧甲基纖維素鈉及碳酸鈣，滅菌，冷卻至室溫； 第三步:接種后，進行發酵靜置培養；
第四步:發酵結束后，得到BC膜，除去殘留的細胞及發酵液；
第五步:用濃度為20-100 g/L的醋酸浸泡BC膜，除去纖維孔洞間包埋的碳酸鈣； 第六步:用去離子水沖洗BC膜，至中性即可。
[0007]第一步中，種子液配方為:葡萄糖20 g/L、硫酸銨6 g/L、磷酸二氫鉀I g/L、硫酸鎂0.4 g/L、蛋白胨3 g/L、酵母浸粉2.25 g/L、羧甲基纖維素鈉0.4 g/L。
[0008]第二步中，發酵液配方為:葡萄糖22.5 g/L、蔗糖27.5 g/L、硫酸銨I g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、硫酸鎂0.7 g/L、乳酸鈣0.2 g/L、檸檬酸0.6 8/1、醋酸1.5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉7.5 g/L;羧甲基纖維素鈉在發酵液中的濃度為5-25 g/L，碳酸鈣在發酵液中的濃度為1-10 g/L O
[0009]第三步中，接種量為2-20%，在30°C條件下靜態培養條件。
[0010]本發明與現有技術相比其顯著優點是:
1、發酵過程綠色環保，碳酸鈣是常用的無機化合物，無毒無害，且顆粒尺寸大小分布均勻。
[0011]2、結構調節后的細菌纖維素后處理容易，直接用酸浸泡即可，不會對已經調節過的結構產生影響。
[0012]3、木醋桿菌在在發酵過程中會分泌酸性物質，碳酸鈣能中和這些酸性物質，使環境PH維持在適宜的水平，有利于細菌纖維素的產生積累。
[0013]下面結合附圖對本發明作進一步詳細描述。
【附圖說明】
[0014]圖1是胞外調節細菌纖維素結構的流程圖。
[0015]圖2是實施例1中使用的碳酸鈣對應的粒徑分布圖。
[0016]圖3是對比例結構未經調節的BC的掃描電鏡圖。
[0017]圖4是實施例1結構經調節的BC的掃描電鏡圖。
【具體實施方式】
[0018]結合附圖1，原位調節細菌纖維素結構的方法，步驟如下:
第一步:木醋桿菌進行種子擴增，搖床震蕩培養，培養溫度25-32°C，搖床轉速90-250rpm，培養時間6-72h ；
第二步:發酵液配制時加入5-25 g/L羧甲基纖維素鈉；待羧甲基纖維素鈉溶解完全后，加入1-10 g/L碳酸鈣，115-121°C高溫滅菌15-30 min后，冷卻至室溫;
第三步:木醋桿菌以2-20%的接種量進行接種(將第一步獲得的種子液加入到第二步獲得的發酵液中)，接種后25-32°C靜態培養；
第四步:發酵結束后，得到BC膜，用質量分數1-10 g/L的NaOH溶液和1-10 g/L的H2O2在70-100°C條件下處理0.5-3.0小時，除去殘留的細胞及發酵液；
第五步:用濃度為20-100 g/L的醋酸浸泡BC膜，除去纖維素網絡中包埋的碳酸鈣； 第六步:用去離子水沖洗BC膜至中性。
[0019]在所有實施案例中，
種子液配方采用:葡萄糖22.5 8/1，蔗糖27.5 g/L，硫酸銨I g/L，磷酸二氫鉀5 g/L,硫酸鎂0.7 g/L，乳酸鈣0.2 g/L,檸檬酸0.6 8/1，醋酸1.5 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉7.5 g/L，羧甲基纖維素鈉0.4 g/L ο
[0020]發酵液配方采用:葡萄糖22.5 g/L，蔗糖27.5 g/L，硫酸銨I g/