重組質粒、利用該重組質粒制備的重組桿狀病毒以及該病毒在疫苗制備中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種經改造的桿狀病毒質粒即重組質 粒，利用該重組質粒制備的含目的基因（間日瘧傳播阻斷候選抗原PVS25基因）的重組桿狀 病毒，該重組桿狀病毒的制備方法，該重組桿狀病毒表達的融合蛋白，以及該重組桿狀病毒 和該融合蛋白在間日瘧傳播阻斷疫苗制備中的應用。
【背景技術】
[0002] 間日瘧是由間日瘧原蟲引起的周期性發作的急性傳染病，特點是間隔48小時反 復發作。如今面世的集中抗瘧疾藥物也由于抗藥性瘧原蟲以及耐殺蟲劑傳播蚊的出現而面 臨挑戰。制備瘧疾疫苗也就成為了能有效控制瘧疾傳播的主要手段。其中傳播阻斷疫苗是 以蚊階段瘧原蟲特異表達的蟲體表面蛋白作為抗原免疫人體，使之產生抗蚊階段瘧原蟲表 面蛋白的特異性抗體。間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25是瘧疾研究的主要靶點，其在不同 地區的痕疾病毒株間具有很商的保守性。
[0003] 現在的生物技術常用的生物體是各種種類的酵母菌核大腸桿菌，但是通過大腸桿 菌表達出來的Pvs25蛋白在傳播阻斷實驗中并沒有檢測到有明顯的免疫原性和免疫保護 性，而用酵母其中的畢赤酵母表達的Pvs25蛋白可以有很好的表達，得到的抗體也可以檢 測到免疫原性和保護性，而且已經進入了臨床I期，但是在進入下一期臨床的時候，人體產 生了排斥反應。現如今表達的哺乳動物表達系統可以看到效果，但是表達量很低，成本相對 較高，不滿足大量生產需要。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是針對以上現有技術的不足，提供一種重組桿狀病毒 質粒，利用該重組質粒構建表面展示間日瘧傳播阻斷候選抗原PVS25的重組桿狀病毒，通 過簡單地分離純化病毒粒子，制備抗體具有良好的抗體效價，能夠為間日瘧傳播阻斷疫苗 的研究提供參考。在家蠶BmN細胞中傳代培養細胞獲得F3代病毒，以此F3代病毒接種家蠶 BmN，從細胞中分離純化獲得病毒粒子，其可以直接作為疫苗，免疫Balb/c小鼠，間接ELISA 檢測抗體效價能達到1:25600。此種方法相比較原核的和其他的真核表達系統生產疫苗的 方法具有安全性好、生產成本低、易于大規模生產操作的特點。
[0005] 本發明所采用的技術方案為：
[0006] 一種重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM，該重組質粒由一段重組序列插入到 pFastBacDual質粒中構建而成，所述重組序列為根據CMV、Pph、SP、TM已知序列，在SP和TM核苷酸序列間加入Xba I酶切位點和Xho I酶切位點，CMV-F前加入Kpnl酶切位點，TM-R 后加入Hindlll酶切位點形成，所述重組序列全長為923bp，如SEQ ID N0:1所示。
[0007] 具體地，所述重組序列插入到pFastBacDual質粒的Kpnl酶切位點和Hindlll酶 切位點之間。
[0008] 本發明進一步提供利用上述重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM構建的重組 桿狀病毒BmPvs25,該重組桿狀病毒由間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25基因插入到重組質 粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM并通過轉座與穿梭載體Bacmid的基因組進行同源重組， 獲得重組桿狀病毒基因組DNA，然后將重組桿狀病毒基因組DNA轉染家蠶細胞，在家蠶細胞 內包裝得到表面展示有間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25的重組桿狀病毒。
[0009] 具體地，所述Pvs25基因插入到重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的Xba I 酶切位點和Xho I酶切位點之間。
[0010] 具體地，所述家蠶細胞為家蠶BmN細胞。
[0011] 穿梭載體Bacmid(即Baculovirusplasmid)為帶有桿狀病毒基因組的質粒，可在 細菌和昆蟲細胞之間穿梭，是Bac-to-bac桿狀病毒表達系統的成員之一，該系統還包括供 體質粒和輔助質粒及大腸桿菌，為現有技術。
[0012] 載體pFastBacDual是Bac-to-bac表達系統的供體質粒，可以插入外源基因并在 輔助質粒編碼的轉座酶作用下，將外源基因插入到Bacmid中。載體pFastBacDual已經商 品化；CMV啟動子為哺乳動物啟動子，將其插入桿狀病毒后，桿狀病毒可以在哺乳動物里表 達外源基因。
[0013] 上述重組桿狀病毒BmPvs25的制備方法，包括以下步驟：
[0014] (1)通過PCR擴增的方法得到間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25基因，然后將Pvs25 基因連接到重組質粒PFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM的XbaI酶切位點和XhoI酶切位點 之間，得到重組轉座質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25-TM;
[0015] (2)將重組轉座質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25_TM轉化含桿狀病毒穿梭 載體Bacmid的大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，進行同源重組，在含有卡那霉素、慶大霉素、 四環素、X-gal和IPTG的LB培養平板上進行藍白斑篩選，避光培養40-48h后挑取白斑，白 斑繼續培養24-48h后抽提重組桿狀病毒基因組DNA進行PCR鑒定；
[0016] (3)取步驟（2)鑒定正確的重組桿狀病毒基因組DNA通過脂質體介導法轉染家蠶 BmN細胞，發病后獲得一代病毒懸液，提取病毒基因組再次進行PCR鑒定，鑒定正確的即為 表面展示間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25的重組桿狀病毒BmPvs25。
[0017] 上述重組桿狀病毒BmPvs25所表達的融合蛋白SP-Pvs25-TM，由間日瘧傳播阻斷 候選抗原Pvs25的N端接gp64分泌性信號肽（SP)、C端接gp64跨膜結構域（TM)構成，其 氨基酸序列如SEQIDN0 :8所示。
[0018] 本發明進一步提供上述重組桿狀病毒BmPvs25在間日瘧傳播阻斷疫苗制備中的 應用。簡單純化病毒粒子后免疫Balb/c雌鼠獲得抗體，間接ELISA測效價可達到1:25600。
[0019] 本發明還進一步提供重組桿狀病毒BmPvs25所表達的融合蛋白SP-Pvs25-TM在間 日瘧傳播阻斷疫苗制備中的應用。
[0020] 與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點和有益效果：
[0021] (1)本發明通過分析間日瘧傳播阻斷候選抗原PVS25基因，發現其含有4個 EGF-1ike結構域，但是本發明中所用到的是經過優化后的編碼138個氨基酸的Pvs25序列。 利用此經過改造后的Pvs25序列作為家蠶表面展示系統的研究，可以作為一種模型用于其 他間日瘧傳播阻斷疫苗的研究。
[0022] (2)本發明將間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25基因與家蠶桿狀病毒囊膜蛋白GP64 基因融合，家蠶桿狀病毒囊膜蛋白GP64含有兩個高度疏水區：N-末端的分泌性信號肽（SP) 和C-末端的跨膜結構域（TM)，與跨膜結構域相連的是親水性結構域，可以把病毒囊膜與宿 主細胞膜內的糖蛋白連接在一起，從而使本發明實現了目的Pvs25蛋白在病毒衣殼上的表 面展示。
[0023] (3)本發明構建的表面展示間日瘧傳播阻斷候選抗原Pvs25的重組桿狀病毒， 可以利用家蠶BmN細胞作為生物反應器和家蠶桿狀病毒表面展示高效表達系統表達具有 極高的臨床應用價值的間日瘧傳播阻斷候選疫苗，通過家蠶桿狀病毒表達系統高效表達 Pvs25蛋白。本方法適用于大規模生產，降低了成本，且產量高，所生產的間日瘧傳播阻斷疫 苗應用價值大。
[0024] (4)目前Pvs25疫苗尚無利用桿狀病毒表面展示技術生產，家蠶桿狀病毒表達系 統是真核表達，具有翻譯后修飾功能，能使表達的蛋白其結構更接近于其天然構象，使其更 加具有免疫活性，通過簡單地分離純化病毒粒子，免疫Balb/c小鼠，獲得的抗體具有良好 的抗體效價。
【附圖說明】
[0025] 圖1所示的是載體pFastBacDual的結構示意圖。
[0026] 圖2所示的是重組質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-TM電泳鑒定圖，其中M:DNA 分子量標準；1 :CMV-Pph-SP-TM基因PCR擴增產物，箭頭位置為目的序列，923bp;2:重組載 體雙酶切產物。
[0027] 圖3所示的是重組轉座質粒pFastBacDual-CMV-Pph-SP-Pvs25_TM的PCR鑒定電 泳圖，其中M:DNA分子量標準，1 :Pvs25目的基因PCR擴增產物，2 :Pvs25目的基因雙酶切 產物。
[0028] 圖4所示的是重組桿狀病毒BmPvs25的PCR產物電泳鑒定圖，其中M:DNA分子量 標準；1.M13F和M13R為上下游引物PCR結果；2.M13F和TM基因下游引物PCR結果；3.CMV 上游引物和M13R為引物PCR結果。
[0029] 圖5所示的是重組桿狀病毒BmPvs25的Pvs25蛋白WesternBlot檢測結果圖，其 中M:蛋白分子量標準，1:接種重組BmPvs25的發病細胞，2:正常細胞。
[0030] 圖6所示的是激光共聚焦鑒定融合重組病毒在家蠶BmN細