Lamp1綠色熒光表達載體、其制備方法及應用
【專利說明】LAMP1綠色熒光表達載體、其制備方法及應用 【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及重組表達載體的構建，具體涉及一種LAMP1綠色 熒光表達載體、其制備方法及應用。 【【背景技術】】
[0002] 溶酶體（lysosome)是真核細胞中由單層脂蛋白膜包繞的含一系列酸性水解酶的 小體，是細胞內吞、細胞自噬兩條代謝途徑的共同終點。溶酶體既能通過與吞噬體融合，酸 化水解通過細胞內吞途徑進入細胞的生物大分子物質，調節細胞水平的信號傳遞；又能通 過與自噬體融合，降解通過自噬途徑包裹到自噬體中的細胞器和內源性生物大分子，為細 胞提供生物合成的新原料。通過熒光顯微技術觀察溶酶體的亞細胞定位對于研究細胞內 吞、細胞自噬兩條代謝途徑意義重大。傳統的應用于觀察溶酶體的方法主要是免疫熒光染 色和電鏡觀測兩種方法，其中，免疫熒光細胞化學是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的 抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體(或抗原）作為分子探針檢 查細胞或組織內的相應抗原(或抗體)，在細胞或組織中形成的抗原抗體復合物上含有突光 素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發光的照射而發出明亮的熒光(黃綠色或桔紅 色)，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技 術測定含量，使用抗體將溶酶體體特異性表達的蛋白質LAMP1上標記上熒光信號，可以用 熒光顯微鏡下或激光共聚焦顯微鏡觀察溶酶體的亞細胞定位；而電鏡是利用電子與物質作 用所產生之訊號來監定微區域晶體結構，微細組織，化學成份，化學鍵結和電子分布情況的 檢測手段。使用電鏡技術通過觀測細胞切片或組織切片中細胞微細結構，依據形態可鑒別 溶酶體。
[0003] 以上兩種方法中，使用免疫熒光鑒定溶酶體依賴于高效價的LAMP1抗體，這樣不 僅步驟繁瑣，而且實驗成本高；而用電鏡法鑒定溶酶體體，依賴于研究人員豐富的形態學分 析經驗，難度比較大，不易于普及；而且上述兩種方法都需要先將細胞固定滅活后，再檢測， 無法進行活細胞觀察。 【
【發明內容】
】
[0004] 本發明的目的在于克服上述不足之處，提供一種LAMP1綠色熒光表達載體，解決 現有技術中溶酶體靶細胞定位檢測中步驟繁瑣、實驗成本高以及無法進行活細胞檢測的技 術問題。
[0005] 本發明為解決上述技術問題所采用的方案如下：
[0006] 一種一種LAMP1綠色熒光表達載體，表達LAMP1和綠色熒光蛋白的融合蛋白，所述 表達載體以pEGFP-cl載體為骨架載體，在pEGFP-cl載體多克隆位點融合了LAMP1編碼基 因。
[0007] 優選地，所述LAMP1編碼基因位于pEGFP-cl載體的EcoRI/BamHI之間。
[0008] 優選地，所述表達載體的核苷酸序列為序列表中的SEQIDNo:5。
[0009] 本發明還提供了一種制備LAMP1綠色熒光表達載體的方法，包括如下步驟：
[0010] 步驟1 :用人類子宮頸癌細胞Hela細胞的CDNA作為模板進行PCR擴增，獲得含有 EcoR I和BamH I酶切位點的LAMP1 DNA片段，其中，所述PCR擴增引物為序列表中的SEQ ID No :1 和 SEQ ID No :2 ;
[0011] 步驟2 :將所得LAMP1DNA片段和pEGFP-cl載體分別用EcoR I和BamH I進行雙 酶切，得到LAMP1基因和酶切后的pEGFP-cl載體；
[0012] 步驟3 :將所得LAMP1基因和酶切后的pEGFP-cl載體用DNA連接酶進行連接，得 至lj pEGFP-cl-LAMPl 載體。
[0013] 優選地，所述步驟1中PCR擴增的反應條件為：起始98°C5min;然后98°C10s， 58°C30s，70°C2min，進行 35 個循環；最后 72°ClOmin。
[0014] 優選地，所述步驟2中LAMP1基因和酶切后的pEGFP-cl載體的質量比為 2. 5:1-5:1 ;所述步驟2中所用的DNA連接酶為T4DNA連接酶。
[0015] 優選地，所述步驟2和所述步驟3之間還包括如下步驟：
[0016] 將所得LAMP1基因和酶切后的pEGFP-cl載體進行純化。
[0017] 本發明還提供了用上述的表達載體轉染的細胞，其中，所述細胞為真核細胞。
[0018] 本發明還提供了一種細胞檢測試劑，包括上述的表達載體。
[0019] 本發明另外還提供了上述的表達載體或上述的細胞檢測試劑在檢測溶酶體在靶 細胞中定位的用途。
[0020] 與現有技術相比，本發明的有益效果在于，本發明的種LAMP1綠色熒光表達載體 能夠表達LAMP1和綠色熒光蛋白的融合蛋白，將溶酶體進行熒光標記，能夠對活體靶細胞 中溶酶體的定位進行檢測并在顯微鏡下觀察，操作簡單，實驗成本低。 【【附圖說明】】
[0021] 圖1是本發明實施例的pEGFP-cl載體結構圖。 【【具體實施方式】】
[0022] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合附圖和具體實施 例對本發明作進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明， 并不用于限定本發明。
[0023] 除非另有定義，本發明使用的所有科技術語具有本領域普通技術人員所理解的相 同含義。關于本領域的定義及術語，專業人員可參考Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel)。氨基酸殘基的縮寫是本領域中所用的指代20個常用L-氨基酸之一 的標準3字母和/或1字母代碼。
[0024] 盡管本發明的廣義范圍所示的數值本來就必然含有一定的誤差，其是由它們各自 測量中存在的標準偏差所致。另外，本發明公開的所有范圍應理解為涵蓋其中包含的任何 和所有子范圍。例如記載的"1至10"的范圍應理解為包含最小值1和最大值10之間(包 含端點）的任何和所有子范圍；也就是說，所有以最小值1或更大起始的子范圍，例如1至 6. 1，以及以最大值10或更小終止的子范圍，例如5. 5至10。另外，任何稱為"并入本文"的 參考文獻應理解為以其整體并入。
[0025] 另外應注意，如本說明書中所使用的，單數形式包括其所指對象的復數形式，除非 清楚且明確的限于一個所指對象。術語"或"可與術語"和/或"互換使用，除非上下文另 有清楚指明。
[0026] 術語"部分"和"片段"可互換的指代多肽、核酸或其他分子構建物的一部分。
[0027] 綠色熒光蛋白（GFP)來源于維多利亞多管發光水母，經基因工程改造后的突變型 GFP蛋