基于體外共培養激活Notch-1信號通路的方法
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物信息學技術領域，特別涉及一種基于體外共培養激活NotCh-1信號通路的方法。
【【背景技術】】
[0002]NotCh-1是參與乳腺癌的發展和進展的一個重要致癌基因。Notch信號通路在細胞增殖、細胞凋亡、分化、侵襲、血管生成、腫瘤的轉移和乳腺癌干細胞自我更新的過程中起著非常關鍵的作用。它是跨膜蛋白受體家族，通過和配體結合激活其活性。迄今為止，該家族中有四個 Notch 受體(Notch-l、2、3、4)和 5 個配位體(Dll-1、Dll-3、Dll-4、Jagged-1和Jagged-2)已被確定。Notch和配體結合后，需要通過兩步酶切形成最終的活性Notch(Notch 細胞內部分 intracellular Notch ICN)。最后執行剪切的酶是 gamma-secretase ( Y分泌酶)，使用小分子抑制劑GSI (gamma-secretase inhibitor)可以抑制Y分泌酶的活性，阻止最后的酶切反應，進而抑制Notch的信號轉導。活化的Notch-1轉移到細胞核內，主要通過結合轉錄因子CBF-1來調控基因表達。乳腺癌中，Notch-1是非常重要的致癌基因和新的藥物靶點。但Notch-1如何調控癌細胞生存、生長的機制不清楚。
[0003]Notch的抑制劑GSI已經進入乳腺癌臨床一 / 二期研究，(請參見http: //www.clinicaltrials.gov/ct2/results?term=gamma_secretase++breast+cancer&Search=Search)。因此,研究Notch-1的致癌機理為臨床使用祀向Notch-1的藥物提供堅實的轉化醫學基礎。在研究Notch-1的致癌機理的過程中，有效的在體外培養環境中激活Notch-1的/[目號通路成為成功揭不致癌機理的必備工具。
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【發明內容】
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[0004]為克服上述現有技術的缺點和不足，本發明的目的在于提供一種基于體外共培養激活Notch-1信號通路的方法。本發明具體是通過將乳腺癌細胞與表達Jadde-1的成纖維細胞共同培養，通過成纖維細胞分泌Jadde-1及模擬體內細胞接觸實現穩定激活乳腺癌細胞中的Notch-1信號通路的目的。
[0005]本發明的目的通過以下技術方案實現:一種基于體外共培養激活Notch-1信號通路的方法，包括如下步驟:
[0006](I)將乳腺癌細胞和穩定表達Notch-1配體的間質細胞分別在含體積分數10%小牛血清的DMEM培養基中培養；
[0007](2)待步驟(I)中的兩種細胞分別生長到80%的密度，用PBS緩沖液清洗并收集穩定表達Notch-1配體的間質細胞；
[0008](3)在含體積分數10%小牛血清的DMEM培養基中培養重懸步驟(2)中收集的穩定表達Notch-1配體的間質細胞,按1:1-2:1的將穩定表達Notch-1配體的間質細胞加入到乳腺癌細胞中；共同培養0.5?48h，實現激活乳腺癌細胞中Notch-1信號通路。
[0009]步驟(I)中:
[0010]所述的乳腺癌細胞優選為三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231 ；
[0011]所述的穩定表達Notch-ι配體的間質細胞優選為表達Jaddeg-1的小鼠成纖維細胞LTK-JAG細胞；
[0012]所述的LTK-JAG細胞的制備方法請見文獻:Lindsell C.E.，ShawberC.J., Boulter J., Weinmaster G.Jagged:a mammalian ligand that activates Notchl.Cell.1995;80:909-917 ；
[0013]所述的培養的條件優選為于37°C、體積分數5%的CO2中進行培養。
[0014]步驟(2)中所述的PBS緩沖清洗并收集的步驟優選為將穩定表達Notch-1配體的成纖維細胞通過細胞收集刮收集至5ml PBS緩沖液中，離心1000 X g，5分鐘，棄上清；
[0015]步驟(3)中所述的培養的條件優選為于37°C、體積分數5%的CO2中進行培養。
[0016]本發明的發明機理為:本方法模擬體內激活機制，使用表達Notch配體的Jagged-1小鼠成纖維細胞與乳腺癌細胞共培養的方法，實現在體外激活Notch-1的信號通路的目的。Notch傳統信號通路如圖1所示。Notch從細胞膜釋放后,NIC (intracellularNotch)轉移至細胞核并結合轉錄因子CBF-1來調控基因表達。沒有Notch的狀態下，CBF-1是基因表達抑制因子。它通過在啟動子區結合輔抑制因子包括SMRT(Silencing mediatorof retinoid and thyroid hormone receptors),nCOR (Nuclear corepressor)和組蛋白去乙酰化酶抑制基因(HDACl)表達。細胞核里的Notch取代這些輔抑制因子并結合輔激活因子包括組蛋白乙酸化酶PCAF、GCN5或p300以及MAMLl (mastermindlikeI)。Notch革巴基因有 HES (hairy enhancer of split genes)和 HERP (HES-related repressor protein)、HEY家族、cyclin D、c_Myc、以及NF- κ B轉錄因子家族。
[0017]本發明相對于現有技術具有如下的優點及有益效果:
[0018]本發明中的基于乳腺癌細胞和表達Notch配體Jagged-1的成纖維細胞共培養的新方法在體外來激活腫瘤細胞Notch-1信號通路，相比于過表達的傳統方法，該方法更好模擬在體內環境中癌細胞中Notch-1與間質細胞表達的Jagged-1相互作用來激活Notch-1信號通路，克服了傳統方法中過表達的標準量難以確定、轉染的效率難以確定、部分細胞根本沒有被轉染的缺陷；避免了過表達方法中過表達無法全面有效的激活Notch-1信號通路，所得生物學結果不客觀的情況。本發明中兩種細胞共培養的方法模擬在體內生理條件下跨膜蛋白受體Notch-1家族通過和配體結合激活其活性的特性，更加生物學的激活Notch-1彳目號通路。
【【附圖說明】】
[0019]圖1是Notch傳統信號通路的示意圖。
[0020]圖2是實施例1中激活Notch信號通路的示意圖
【【具體實施方式】】
[0021]下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的保護范圍并不限于此。
[0022]以下實施例中所用的三陰乳腺癌細胞株MDA-MB-231來源于A TCC, LTK-PAR(小鼠成纖維細胞不表達Jaddeg-Ι)和LTK-JAG細胞(小鼠成纖維細胞表達Jaddeg-1)由Dr.G.Weinmaster (University of California at Los Angeles, Los Angeles, CA)構建并提供。
[0023]實施例1