一種胎盤造血干細胞的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體的說是涉及一種胎盤造血干細胞的制備方法。
【背景技術】
[0002] 造血干細胞（HemopoieticStemcell，HSC)是存在于造血組織中的一群原始造血 細胞，它不是組織固定細胞，可存在于造血組織及血液中。造血干細胞是所有造血細胞和免 疫細胞的起源，具有自我更新和多向分化能力。它的基本特性是具有自我更新能力，即經過 一個細胞周期活動之后，可以產生兩個與分裂前性質相同的造血干細胞，同時又具有多向 分化能力，即在一定的環境條件下，造血干細胞具有向各系血細胞分化的能力。
[0003] 隨著對造血干細胞（HSC)日漸深入的研宄，HSC移植已經成為治療許多惡性血液 系統疾病及其他腫瘤的有效手段。目前，HSC的主要來源是骨髓、外周血及臍血，骨髓和外 周血HSC增殖和分化能力下降，并且易受供者健康狀態影響，而臍血HSC數量有限，這些限 制因素使其不能滿足日漸增長的HSC臨床應用需求。近年來，國內外學者研宄發現，胎盤中 含有大量的早期干細胞，包括數量豐富的造血干細胞。這些干細胞在胎盤中行使著造血的 功能。小孩出生后剝離的胎盤內所含的造血干細胞，是臍帶血的8-10倍，可供小孩自用幾 次，甚至可提供給多個成人患者的治療。胎盤造血干細胞的成功分離和提取可解決臨床上 HSC的來源問題，具有廣闊的臨床應用前景。
[0004] 目前，胎盤HSC的分離提取方法主要采用機械法、機械酶解法等，但這兩種方法提 取過程操作繁復、耗時長、成本高，不太適用于大規模的生產制備。
[0005] 中國專利CN103789262A公開了一種臨床應用級胎盤造血干細胞的制備方法，其 以酶解灌注法進行造血干細胞的制備，最終獲得的⑶34陽性細胞數在1. 2-1. 6X109,但 是，該方法在酶解時間極短的前提下，該效果數據基本不可能達到十億級，并且經過對該專 利方法試驗驗證，其單個核細胞總數最高在1〇 8數量級，單個核細胞活率較低，在60-65 %， CD34陽性細胞僅在105數量級，明顯與其記載的試驗結果不相符。
[0006] 同時，從其提供的流式檢測圖可知，只有FSC/SSC檢測的細胞圖，這個流式圖代表 的是細胞檢測數量，且其提取出來的細胞并未經過流式CD34抗原的檢測，其總提取細胞是 單個核細胞，并非CD34陽性細胞。進行流式檢測一般是對提取細胞進行重懸后（總體積V)， 取少量細胞懸液（檢測體積VI)、細胞數量約為IX106cell，進行染色后上機檢測。根據檢 測細胞中CD34陽性的細胞含量，從而計算出總細胞中含有的CD34陽性的細胞。
[0007]雖然，上述現有專利以酶解灌注法進行胎盤造血干細胞的制備，雖然相比機械法 和機械酶解法更簡便，耗時短、成本低，但是最終獲得的細胞數量和活力卻不夠理想，需要 進一步進行改進。
【發明內容】
[0008] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種胎盤造血干細胞的制備方法，使得所述制 備方法能夠提包含造血干細胞的單個核細胞數量及其活細胞數量以及CD34陽性細胞數 量。
[0009] 為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0010] 一種胎盤造血干細胞的制備方法，包括以下步驟：
[0011] 步驟1、胎盤預處理后，用灌洗液灌注清洗胎盤；
[0012] 步驟2、將酶解液從胎盤動脈灌注至胎盤靜脈流出酶解液停止并結扎胎盤動靜脈 靜置，所述酶解液為包括I型膠原酶、透明質酸酶、胰蛋白酶、枸櫞酸鹽緩沖溶液、青-鏈霉 素雙抗、罌粟堿、N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基礎培養基；
[0013] 步驟3、松開胎盤動靜脈并從動脈灌注所述灌洗液，從靜脈處收集全部酶解液體， 離心取細胞沉淀，然后依次經羥乙基淀粉法和紅細胞裂解法回收純化包含造血干細胞的單 個核細胞，重懸后獲得所述胎盤造血干細胞。
[0014] 針對現有酶解灌注法獲取的胎盤造血干細胞數量以及活率不高的問題，本發明 從改進酶解液組成出發，以多種適宜的組分組成全新的酶解液，使其不僅能夠動員胎盤內 部的造血干細胞并在短時間內迅速進入血液循環系統，同時提高了造血干細胞的數量和活 率，解決了現有技術的問題。
[0015] 本發明所用胎盤由某醫院婦產科提供，選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性 且無產科并發癥的胎盤，術前經得產婦知情同意并簽署知情同意書。術前準備無菌聚苯乙 烯胎盤采集盒作為運送容器，內裝胎盤保存液，采集后4°C條件下12小時內送到制備處分 離制備胎盤造血干細胞。
[0016] 本發明技術方案中所用試劑均市售獲得，例如DMEM高糖基礎培養基可購自于 Gibco公司。
[0017]作為優選，步驟1所述灌洗液灌注清洗胎盤為：
[0018] 將0-4°C灌洗液灌注進胎盤中的動脈，直至胎盤內血清清洗干凈。
[0019] 為了進一步配合所述酶解液，共同作用于胎盤制備出大量高活力的胎盤造血干 細胞，本發明所述灌洗液優選為包括青-鏈霉素雙抗、EDTA、枸櫞酸鹽緩沖溶液、罌粟堿和 N-乙酰半胱氨酸的PBS緩沖液；更優選地，所述灌洗液為包括1-3倍的青-鏈霉素雙抗、 0? 01-0. 04% (質量百分比）EDTA、1倍的枸櫞酸鹽緩沖溶液、0? 01-0.lmg/mL的罌粟堿和 0. 5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值為7. 0的PBS緩沖液；最優選地，所述灌洗液為包 括1倍的青-鏈霉素雙抗、〇. 02%EDTA、1倍的枸櫞酸鹽緩沖溶液、0. 05mg/mL的罌粟堿和 1. Ommol/L的N-乙酰半胱氨酸的pH值為7. 0的PBS緩沖液。
[0020] 本發明所述1-3倍的雙抗或1倍的枸櫞酸鹽緩沖液均為本領域常規的試劑濃度表 示方法，一般所購買的青-鏈霉素雙抗或所配置的枸櫞酸鹽緩沖液均為高倍母液，在使用 時會稀釋配置成低倍數，如所購買的青-鏈霉素雙抗多數為100倍，而枸櫞酸鹽緩沖液一般 配制成5倍或10倍，其配制方法如磷酸緩沖液屬于本領域公知，作為優選，本發明提供5倍 枸櫞酸鹽緩沖液配制方法，如下：
[0021] 稱取枸櫞酸鈉粉末26. 3g、枸櫞酸粉末3. 27g、葡萄糖12. 7g、磷酸二氫鈉4. 44g、腺 嘌呤0. 55g，把上述各組分溶于400mL的去離子水中，充分攪拌混勻后形成5倍枸櫞酸鹽緩 沖溶液，0.22ym過濾，分裝。
[0022] 在本發明所述制備方法的起始階段，需要對胎盤進行預處理，這一措施屬于本領 域公知，即對胎盤進行消毒、除去胎盤羊膜以及洗滌等步驟，在制備造血干細胞前，本領域 技術人員均知曉這些預處理步驟并能夠根據實際情況選擇具體的預處理步驟。作為優選， 本發明預處理為剝離羊膜并用灌洗液清洗胎盤。
[0023] 作為優選，所述酶解液為包括0. 01-0.lmg/mL的I型膠原酶、0. 01-0.lmg/mL的 透明質酸酶、〇. 001-0. 005% (質量百分比）的胰蛋白酶、1倍的枸櫞酸鹽緩沖溶液、1倍的 青-鏈霉素雙抗、〇. 01-0.lmg/mL的罌粟堿、0. 5-2mmol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖 基礎培養基。
[0024] 更優選地，所述酶解液為包括0. 05mg/mL的I型膠原酶、0. 02mg/mL的透明質酸 酶、0.001 % (質量百分比）的胰蛋白酶、1倍的枸櫞酸鹽緩沖溶液、1倍的青-鏈霉素雙抗、 0. 05mg/mL的罌粟堿、1.Ommol/L的N-乙酰半胱氨酸的DMEM高糖基礎培養基。
[0025] 作為優選，所述羥乙基淀粉法具體步驟為：
[0026] 將細胞沉淀和羥乙基淀粉按體積比細胞沉淀：羥乙基淀粉=1:1-3的比例，用羥 乙基淀粉重懸細胞沉淀，室溫下靜置20-40min，吸取上清離心，離心后棄上清。
[0027] 作為優選，所述紅細胞裂解法具體步驟為：
[0028] 將經羥乙基淀粉法處理后的細胞沉淀和1倍的紅細胞裂解液，按體積比細胞沉 淀：1倍紅細胞裂解液=1:5-10的比例，用1倍的紅細胞裂解液重懸細胞沉淀，渦旋振蕩 5s，室溫下裂解殘留的紅細胞lOmin，離心后棄上清獲得包含造血干細胞的單個核細胞。
[0029] 作為優選，步驟3所述重懸以DMEM高糖基礎培養基重懸。
[0030] 在造血干細胞數量和活率的對比試驗中，以本發明所述制備方法和專利 CN103789262A進行對比，結果顯示，在包含造血干細胞的單個核細胞數量及其活細胞數量、 ⑶34陽性細胞數量上均顯著高于現有對照方法。
[0031] 由以上技術方案可知，本發明改善酶解灌注法工藝，選擇多種相互適宜的組分組 成新型酶解液應用于胎盤造血干細胞制備過程中，不僅能夠動員胎盤內部的造血干細胞并 在短時間內迅速進入血液循環系統，而且同時提高了包含造血干細胞的單個核細胞數量及 其活細胞數量以及CD34陽性細胞數量。
【附圖說明】
[0032] 圖1所示為實施例1制備的造血干細胞不加抗體的流式檢測圖（對照組）；
[0033] 其中，圖1-A為檢測單個核細胞總數的流式檢測圖，所圈區域P2即表示單個核細 胞總數所占百分比（5. 4% )，圖1-B為檢測CD34陽性細胞數的流式檢測圖，右側百分比為 CD34陽性細胞在單個核細胞中的百分比；
[0034] 圖2所示為實施例1制備的造血干細胞加抗體的流式檢測圖（檢測組）；
[0035] 其中，圖2-A為檢測單個核細胞總數的流式檢測圖，所圈區域P2即表示單個核細 胞總數所占百分比（5. 2% )，圖2-B為檢測CD34陽性細胞數的流式檢測圖，右側百分比為 CD34陽性細胞在單個核細胞中的百分比。
【具體實施方式】
[0036] 本發明實施例公開了一種胎盤造血干細胞的制備方法。本領域技術人員可以借鑒 本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技 術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法已經通過較佳實施 例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的產品及 方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0037] 為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的一種胎盤造血干細胞的 制備方法進行詳細說明。
[0038] 實施例1 :本發明所述胎盤造血干細胞的制備方法
[0039] 選取肝炎、梅毒、艾滋病等傳染病檢測陰性且無產科并發癥的胎盤，術前經得產婦 知情同意并簽署知情同意書。術前準備無菌聚苯乙烯胎盤采集盒作為運送容器，內裝胎盤 保存液，采集后4°C條件下12小時內送到制備處分離制備胎盤造血干細胞。
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