一種解脂耶氏酵母及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株解脂耶氏酵母及其應用，屬于發酵領域。
【背景技術】
[0002](R)-苯乙醇及其衍生物是合成多種手性藥物如(R)-地諾帕明、(R)-托莫西汀、(S)-氟西汀、(R)-沙丁胺醇等的重要中間體。為獲得光學活性純苯乙醇，應用最廣的是化學催化不對稱合成法，但是其存在反應條件劇烈，環境不友好的缺陷。近年來，生物催化法因反應條件溫和、產物立體選擇性高、對環境友好等優點成為獲得光學活性產物的另一種有效途徑。目前，生物催化法制備手性芳香酮的相關報道較多，但仍然無法實現工業化生產，主要原因是生產菌株催化活性不穩定、產物積累量不高及立體選擇性較差。
[0003]解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica),屬于子囊酵母，是被廣泛研究的非常規菌種之一，該菌株安全、無毒，既能在海水中也能在淡水中生存，可以以葡萄糖、乙醇、乙酸和脂肪酸、烴類等物質為碳源進行生長，通常用于有機廢水的處理或者油脂的富集。Giancarlo Fantin etal., “Ant1-Prelog Microbial Reduct1n of Prochiral CarbonylCompounds”, Tetrahedron, Vol.52.N0.10, pp.3547-3552，報道了部分解脂耶氏酵母可以將苯乙酮轉化為(R)-苯乙醇，但是均難以兼顧轉化率和產物純度(產物e.e.值)，轉化率為55-70%時，產物純度僅為75%左右，產物純度接近100%時，轉化率最高僅25%。
【發明內容】
[0004]本發明提供了一種新的解脂耶氏酵母及其在將苯乙酮轉化為(R)-苯乙醇中的應用。
[0005]本發明解脂耶氏酵母，它是由中國典型培養物保藏中心保藏的保藏號:CCTCC M2013606 的解脂耶氏酵母 cmq6_8 (Yarrowia lipolytica cmq6_8)。
[0006]本發明解脂耶氏酵母cmq6_8 (Yarrowia lipolytica cmq6_8),于 2013 年 11 月 27日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，其地址為:中國.武漢.武漢大學，保藏號為CCTCC M 2013606。
[0007]本發明還提供了將苯乙酮轉化為(R)-苯乙醇的方法，包括如下步驟:
[0008](I)取保藏號:CCTCC M 2013606 的解脂耶氏酵母 cmq6_8 (Yarrowia lipolyticacmq6-8),加水至菌體細胞的濃度達到0.2?0.3g/ml,調pH為6.8?7.2,加甘油至濃度為I ?3% (v/v)；
[0009](2)往步驟(I)的溶液中加入底物苯乙酮至濃度為30?60mmol/L，在溫度25?35°C的條件下反應至少24h，即可。
[0010]步驟(I)中，所述菌體細胞的濃度為0.25g/mL。
[0011]步驟(I)中，調節pH為7.0。
[0012]步驟(I)中，所述甘油的濃度為2% (v/v)。
[0013]步驟(2)中，所述底物苯乙醇的濃度為45mmol/L。
[0014]步驟(2)中，所述反應溫度為30°C。
[0015]步驟(2)中，所述反應時間為36h。
[0016]步驟(2)中，在添加底物苯乙酮時，同時添加乙醇至濃度為I?3 (v/v)。優選地，所述乙醇濃度為2 (v/v)。
[0017]本發明解脂耶氏酵母，能夠高效地將苯乙酮轉化成(R)-苯乙醇，可以兼顧轉化率和產物純度，轉化獲得的產物純度(產物e.e.值)大于99%，同時，底物轉化率高達78.4%，工業應用前景良好。
[0018]顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0019]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0020]圖1基于26S rDNA Dl / D2區域序列和Neighbor-Joining法構建的系統發育樹
【具體實施方式】
[0021]實施例1本發明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的鑒定特征
[0022]1、鑒定方法
[0023]將從成都某手性化工廠污水處理池附近采集的土壤樣品中分離得到的本發明菌株，進行如下生理生化和分子生物鑒定。
[0024](I)生理生化特征
[0025]利用顯微鏡及肉眼觀察細胞及固體平板上的菌落形態，并根據《酵母菌的特征與鑒定手冊》所列的酵母菌種鑒定方法進行生化特征分析。
[0026](2)分子生物學鑒定
[0027]a、酵母基因組DNA提取:參考《酵母基因組提取試劑盒》的操作說明，提取酵母基因組DNA。
[0028]b、26S rDNA Dl / D2區域的PCR擴增:26S rDNA Dl / D2區域的PCR擴增采用通用弓 I 物對 NLl (5' -GCAT CAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ’)和 NL4 (5' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 ’)PCR 反應體系(50μ L):10XPCR 緩沖液，5.0μ L ;Mg2+(5mmol / L)，3.0 μ L ;dNTP (各2.5mmol / L)，4.0 μ L ;引物(10 μ mol / L)各 1.0 μ L ；TaqDNA 聚合酶 0.5 μ L ;模板DNA2.0μ L ;去離子水 33.5uL。擴增程序為:94°C 1min ；94°C lmin，50°C lmin，72°C Imin ；35個循環后72°C 1min0取5 μ L產物于1%的瓊脂糖凝膠(含GV染料)電泳，紫外燈下觀測結果。
[0029]C、序列分析和系統樹的構建:將擴增出的PCR產物40 μ L,送華大基因公司(北京)完成測序工作。根據供試菌株的26S rDNA序列，運用Blast程序在GenBank數據庫中分別進行同源序列搜索。根據同源序列搜索的結果，下載相關菌種的26S rDNA序列，與供試菌株的序列一同用Clustal X1.83軟件進行多序列比對，結果采用MEGA3.1中的鄰接法(Neighbor.Joining)進行系統樹的構建，并用Bootstrap對進化樹進行1000次可信度分析。
[0030]2、鑒定結果
[0031](I)生理生化特征
[0032]菌落成圓形，邊緣整齊，乳白色，不透明，有光澤，質地軟；顯微鏡下菌株cmq6-8的細胞呈卵圓形，無菌絲體、未見出芽，有子囊孢子，有擲孢子產生；糖發酵試驗:麥芽糖+，葡萄糖+，乳糖-;碳源同化試驗:麥芽糖+，乳糖V，甘露醇V;未形成類淀粉化合物；在葡萄糖濃度為50%時菌未生長；可以分解尿素。
[0033](2) 26S rDNADl / D2 區域序列分析
[0034]PCR獲得了本發明菌株的26S rDNA D1/D2區域序列長度為593bp，利用BLAST軟件將該序列與GenBank中收錄的DNA序列進行比對，并與相關菌種構建進化樹(如圖1所示)。圖中顯示本發明分離菌株與解脂耶氏酵母ATCC18942 (AF335986)聚成一支，序列同源性> 99.00%，表明兩者親緣關系最近。
[0035]結合生理生化特征和分子生物學鑒定結果，將本發明分離菌株鑒定為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),命名為解脂耶氏酵母 cmq6_8 (Yarrowia lipolyticacmq6-8)，并于2013年11月27日保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCM2013606。
[0036]實施例2采用本發明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)將苯乙酮轉化為(R)-苯乙醇的方法
[0037]1、實驗材料
[0038]1、斜面培養基:
[0039]去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，ddH201000mL, pH自然。
[0040]2、種子培養基:
[0041]蛋白胨1g,酵母膏 5g,葡萄糖 20g, ddH201000mL, pH7.0。
[0042]3、發酵培養基:
[0043]蛋白胨10g，酵母膏 5g，葡萄糖 20g，(NH4) 2S045g，KH2P042g，ddH201000mL，ρΗ7.0。
[0044]4、實驗菌株:本發明保藏號為CCTCC Μ2013606的解脂耶氏酵母cmq6_8 (Yarrowialipolytica cmq6_8)。
[0045]2、實驗方法
[0046](I)、菌體細胞的培養
[0047]種子培養:用無菌牙簽從PDA斜面上挑取少量菌苔接種于20mL種子培養基中，300C，170r/min,搖床培養 24h。
[0048]發酵培養:按5%的接種量將種子液接入50mL發酵培養基中，30°C，170r/min,搖床培養48h。
[0049]收集菌體細胞:收集發酵液，于6000r/min，4°C，離心1min后