一種金槍魚魚骨膠原蛋白源鋅螯合膠原肽及其制備方法和用圖
【專利說明】一種金槍魚魚骨膠原蛋白源鋅螯合膠原肽及其制備方法和用途
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技術領域
[0002]本發明涉及一種金槍魚魚骨膠原蛋白源鋅螯合膠原肽及其制備方法和用途，屬于水產品精深加工技術領域。
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【背景技術】
[0004]膠原肽以其在醫藥、保健品、食品和化妝品等應用上的獨特功效被越來越多的消費者所青睞，使其成為食品行業和保健品行業、日化行業所競相關注的焦點。鋅是人體必須的微量元素，其缺乏可導致兒童生長發育不良、智力發育落后、免疫力降低等病癥。傳統的鋅補充劑(如葡萄糖酸鋅、檸檬酸鋅)穩定性差，吸收利用率低，腸胃刺激大，不易長期服用。而鋅與金屬螯合肽形成的螯合鹽，即可促進微量元素的吸收，同時又能滿足機體對活性肽、氨基酸等的需求，得到了國內外學者的廣泛關注。
[0005]金槍魚是遠洋漁業的重要魚類，年捕獲量超過600萬噸。金槍魚加工過程中，占總重量25%- 30%魚骨多數加工成魚骨粉或者作為廢棄物丟掉，浪費的寶貴的漁業資源。經檢索，以金槍魚魚骨膠原蛋白制備鋅螯合膠原肽未見報道。基于此，本發明根據鋅螯合膠原肽和金槍魚魚骨的研宄現狀，提供一種具有金屬鋅螯合活性的膠原肽，并提供這種鋅螯合膠原肽的制備方法。
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【發明內容】
[0007]本發明所要解決的第一個技術問題是針對上述的技術現狀提供一種源于金槍魚魚骨膠原蛋白的鋅螯合膠原肽。
[0008]本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種源于金槍魚魚骨膠原蛋白的鋅螯合膠原肽的制備方法。
[0009]本發明為解決上述第一個技術問題所采取的技術方案為:一種源于金槍魚魚骨膠原蛋白的鋅螯合膠原肽，其特征在于該膠原肽的氨基酸序列為Gly-Lys-Thr-Gly-Trp-Pro-Gly (GKTGWPG)，ESI/MS 檢測分子量為 701.73 Da0
[0010]本發明為解決上述第二個技術問題所采取的技術方案為:一種源于金槍魚魚骨膠原蛋白的鋅螯合膠原肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
I)金槍魚魚骨的預處理:按照料液比I g:10~15 mL向金槍魚魚骨中加0.1 mol/L NaOH溶液于4°C下浸泡3~5 h，脫除非膠原蛋白；處理后魚骨用蒸餾水反復洗滌至pH 6.5-7.0,瀝干，按照料液比I g: 5-10 11^加入0.5 mol/L EDTA溶液(pH 7.4)，于4°C下浸泡3~5天，每天更換I次EDTA溶液，脫除魚骨中的鈣，干燥、粉碎，得脫鈣魚骨粉。
[0011]2)金槍魚魚骨膠原蛋白的制備:按照料液比I g:3~5 mL向脫鈣魚骨粉加入0.5mol/L乙酸溶液并在4°C下浸泡2~3 d，12 000 g離心30 min后取上清液，加入NaCl至溶液終濃度為0.8~1.0 mol/L，靜置30~60 min, 15 000 g離心25~30 min得沉淀物，冷凍干燥即為魚骨膠原蛋白。
[0012])金槍魚魚骨膠原蛋白的酶解:按照料液比Ig:15-20 mL向膠原蛋白中加入超純水，用HCl調溶液pH到1.5-2.5，按照膠原蛋白質量的1.5-2.0%向膠原蛋白溶液中加入胃蛋白酶(酶活力彡1.6X105 U/g)，酶解3~5 h后，將溶液升溫至90 °C ~ 95°C，并于此溫度保持10~15min后，冷卻至室溫；用NaOH調溶液pH到7.5-8.5，按照膠原蛋白質量的1.2-1.5%向溶液中加入胰蛋白酶(酶活力彡2.5 X 14 U/g)，于溫度35~45°C下酶解3~4 h，得酶解產物；
4)金槍魚魚骨鋅螯合膠原肽的制備:將制備的膠原蛋白酶解產物采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得超濾酶解液，超濾酶解液按照體積比加入到裝有10?15倍DlOl大孔樹脂的層析柱中，用3?5倍柱體積水洗脫除去雜質，然后用5?8倍柱體積的95%乙醇進行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得膠原肽混合物，膠原肽混合物依次經凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到金槍魚魚骨鋅螯合膠原肽。
[0013]作為優選，所述步驟4)的凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
凝膠柱層析:將上述膠原肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為10~20 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據214 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高Zn螯合活性的峰為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成45~55 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對Zn的螯合活性得I個高Zn螯合活性膠原肽Gly-Lys-Thr-Gly-Trp-Pro-Gly (GKTGWPG)。
[0014]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量15~20 μ L ;色譜柱為Zorbax C18 ;流動相:30%乙腈；洗脫速度0.8-1.0 mL/min ;紫外檢測波長214 nm。
[0015]本發明基于多肽與金屬離子螯合的理論基礎，以及多肽-Zn螯合物的獨特功效(可同時補充多肽/氨基酸和Zn)，以金槍魚魚骨為原材料，通過對胃蛋白酶和胰蛋白酶的酶解條件控制，制備具有高Zn螯合活性的膠原肽。本發明即為補鋅保健食品和藥物開發提供了一種技術支持，同時也為金槍魚魚骨的高值化利用提供了一條新思路。
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【附圖說明】
[0017]圖1是本發明的葡聚糖凝膠G-25層析圖。
[0018]圖2是本發明的葡聚糖凝膠G-25制備酶解物的RP-HPLC分析圖。
[0019]圖3 是本發明的 Gly-Lys-Thr-Gly-Trp-Pro-Gly (GKTGWPG)的質譜圖。
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【具體實施方式】
[0021]以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0022]一種源于金槍魚魚骨膠原蛋白的鋅螯合膠原肽的制備方法，制備工藝流程如下:金槍魚魚骨"膠原蛋白提取"酶解"酶解物"超濾"大孔樹脂純化"凝膠過濾層析"RP-HPLC制備〃鋅螯合膠原肽。
[0023]實施例:
I)金槍魚魚骨的預處理:按照料液比I g:15 mL向金槍魚(鰹魚)魚骨中加0.1 mol/L NaOH溶液于4°C下浸泡5 h，脫除非膠原蛋白；處理后魚骨用蒸餾水反復洗滌至pH 7.0、瀝干，按照料液比I g: 5 111]^加入0.5 mol/L EDTA溶液(pH 7.4)，于4°C下浸泡3天，每天更換I次EDTA溶液，脫除魚骨中的鈣，干燥、粉碎，得脫鈣魚骨粉。
[0024]2)金槍魚魚骨膠原蛋白的制備:按照料液比I g:3 mL向脫鈣魚骨粉加入0.5 mol/L乙酸溶液并在4°C下浸泡3 d，12 000 g離心30 min后取上清液，加入NaCl至溶液終濃度為0.9 mol/L，靜置60 min, 15 000 g離心30 min得沉淀物，冷凍干燥即為魚骨膠原蛋白。
[0025])金槍魚魚骨膠原蛋白的酶解:按照料液比Ig:15 mL向膠原蛋白中加入超純水，用HCl調溶液pH到2.0，按照膠原蛋白質量的1.5%向膠原蛋白溶液中加入胃蛋白酶(酶活力彡L 6X 15 U/g)，酶解3~5 h后，將溶液升溫至90 °C~ 95°C，并于此