一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種疫苗效力的檢測方法，尤其是一種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力 檢測方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 雞傳染性支氣管炎病（Infectious Bronchitis, IB)，是一種由冠狀病毒科的傳染 性支氣管炎病毒（Infectious Bronchitis Virus，IBV)引起的雞的急性、高度接觸性傳染 病，給全世界養雞業帶來了巨大損失。目前，接種疫苗是防治該病的有效措施。因此雞傳染 性支氣管炎活疫苗半成品毒液和成品疫苗的效力檢測(效價檢測）非常重要。
[0003] 目前，雞傳染性支氣管炎活疫苗效力檢測的標準方法是雞胚感染法(半數雞胚感 染量，EID5Q)，《中華人民共和國獸藥典》（三部，2010年版）（以下簡稱《中國獸藥典》）中具 體描述：按瓶簽注明羽份，將疫苗用無菌生理鹽水稀釋成1羽份/〇. lml，然后作10倍系列 稀釋，取3個適宜稀釋度，各尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0. lml，置37°C下孵 育144h，24h以內死亡的雞胚棄去不計，根據接種后24~144h的死胚及144h活胚中具有 胎兒失水、蜷縮、發育小（接種胎兒比對照最輕胎兒重量低2g以上）等特異性病痕者的雞胚 總數計算EID 5(I。每羽份應不低于103 5EID5(I。雞胚感染法是當前精確定量的常用方法，已成 為病毒學研究和活病毒生物制品質量監測的重要方法。
[0004] 大多數IBV致雞胚病變，病毒經尿囊腔途徑接種到10~11日齡雞胚后生長良好， 病毒接種后數天可看到特征性的雞胚變化，在照蛋時矮小胚僅有輕微的活動，打開雞胚的 氣室端，可見雞胚縮成球狀，爪畸形，壓在頭上，羊膜增厚并與胚體粘連。經系列稀釋病毒接 種雞胚后，雞胚出現規律性的死亡和特征性的雞胚病變，這類IBV效價測定時適用雞胚感 染法。國內常用的疫苗毒株H120株、H52株、M41株、W93株均適用。
[0005] 但有一部分IBV不致雞胚病變或病變不明顯。病毒經尿囊腔途徑接種到10~11 日齡雞胚后數天，雞胚很少有死亡，且病變不明顯，數次傳代后，病變依舊不明顯，經系列稀 釋病毒接種雞胚后，病變雞胚數量少且不規律。這樣給雞胚感染法結果判定帶來直接的影 響，效價測定結果大相徑庭，是毒價低還是該種方法對其不適用？這為該病毒的研究帶來 了巨大的困難。鑒于當前雞胚感染法存在的不足以及近幾年部分新發現流行毒株的特點， 找到一種適合檢測該類病毒(罕見胚胎死亡，不致雞胚病變或病變不明顯，無法依據雞胚病 變判定效價）效價的有效方法刻不容緩。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是克服現有效力檢測方法之缺陷、提供一種PCR與雞 胚感染法相結合來測定雞傳染性支氣管炎活疫苗效力的檢測方法，以提高效力檢測精確 度。
[0007] 本發明所述技術問題是由以下技術方案解決的。
[0008] -種雞傳染性支氣管炎活疫苗效力的檢測方法，它包括以下步驟： ⑴設計引物：引物對1，其上游引物F1、下游引物R1序列分別為： F1 : SEQ ID NO. 1 ;(5' - GACAAGCAGAGTCTTGT -3'）； R1 : SEQ ID NO. 2 ;( 5' - GCAACCCACACTATACC -3'）； 引物對2,其上游引物F2、下游引物R2序列分別為： F2 : SEQ ID NO. 3 ; (5' - AACAAGGTAGTTGTCCATTG -3'）； R2 : SEQ ID NO. 4 ; (5' - CCATTAATAAAGTAGGCTAGGGC -3'）； 引物對3,其上游引物F3、下游引物R3序列分別為： F3 : SEQ ID NO. 5 ;(5' - CAGGTATGGCTTGGTCTAGCAG -3'）； R3 : SEQ ID NO. 6 ;(5' - CTGAGCTGTTTGTGTTTGGTAAGT -3'）； ⑵病毒稀釋、接種及培養：雞傳染性支氣管炎病毒待檢樣品作10倍系列稀釋，取3個適 宜稀釋度，各尿囊腔內接種10日齡SPF雞胚5枚，每胚0. lml，置37°C下繼續孵育； ⑶病毒收獲：病毒接種后，24h時照蛋1次，棄去死胚不用，72h時將雞胚置于2~8°C 中冷卻4~24h，氣室向上直立。無菌收集尿囊液，標記，-20°C保存備用； (4) PCR 檢測： a. 提取總RNA :將待檢樣品尿囊液、陰性對照和陽性對照分別取樣300W，提取總RNA， 以20W無RNA酶水溶解； b. RT-PCR 反應：RT-PCR 反應體系為 251^1，包括：10XPCR buffer 2. 5W ;dNTP Mixture(10mM each) 2. 5W ;25mM MgCl2 5W ;RNA 酶抑制劑 0? 5ML ;反轉錄酶 0? 5ML ;Taq 酶0? 5W ;上游引物（10剛）1W ;下游引物（10MM) 1W ;總RNA溶解液3. 5W ;ddH20 8耵。 RT-PCR 反應程序為：50°C 30min;95°C預熱 2min ;94°C變性 40s，51°C復性 30s，72°C延伸 lmin，30 個循環；72°C延伸 lOmin。
[0009] c.電泳分析：取PCR產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，而后以凝膠成像系統進 行分析，出現特定大小的目的條帶者即判斷為陽性(該雞胚雞傳染性支氣管炎病毒感染陽 性)。
[0010] (5)毒價計算：統計接種后72h時的雞胚尿囊液(包括24~72h死亡胚和72h活 胚）PCR檢測陽性的雞胚總數，按照Reed-Muench法計算病毒液或活疫苗的效價。
[0011] 步驟⑴、⑷中，使用的引物對1設計在雞傳染性支氣管炎病毒基因組保守區N蛋白 基因上，擴增目的片段大小為438bp ;引物對2設計在雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白基因 上，目的片段大小為292bp ;引物對3設計在雞傳染性支氣管炎病毒S1蛋白基因上，目的片 段大小為635bp。
[0012] 步驟⑵中，待檢樣品為雞傳染性支氣管炎病毒毒液或活疫苗。若待檢樣品為病毒 毒液，直接用無菌生理鹽水或PBS作10倍系列稀釋；若待檢樣品為活疫苗，按瓶簽注明羽份 將疫苗用無菌生理鹽水或PBS稀釋成1羽份/0. lml，然后作10倍系列稀釋。
[0013] 步驟⑷中三對引物的RT-PCR反應體系和反應程序相同。
[0014] 步驟(5)中，如果孵育24~36h各稀釋度毒液接種的雞胚均60%以上(包括60%)存 活；且計算的病毒效價落在各個稀釋度之間，陽性/陰性比率反映出系列稀釋的效果，檢測 結果視為有效。
[0015] 由于采用如上所述的技術方案，本發明具有如下優點： (1)本發明PCR與雞胚感染法相結合，同傳統雞胚感染法相比，避免了目測的誤差和人 為因素導致的結果誤差，使得測定條件均一、可控性強，特異性強，敏感度高，批間誤差小。
[0016] (2)本發明既可以檢測致雞胚病變類雞傳染性支氣管炎病毒，又可以檢測不致雞 胚病變或病變不明顯類雞傳染性支氣管炎病毒，適用范圍更廣。
[0017] (3)傳統的雞胚感染法中結果判定依賴于病變和胚胎體重變化，要求檢測用蛋大 小均勻一致。本發明方法檢測用蛋為任意選擇的普通SPF雞胚，不限定大小差異，材料選擇 范圍更寬。
[0018] (4)與傳統的檢測方法相比，檢測周期縮短了 66~68h，大大提高了檢測效率。
[0019] (5 )本發明不直接檢測待檢毒液，檢測的是各梯度稀釋病毒培養產物雞胚尿囊液， 不受待檢毒液中失活病毒影響，避免了普通PCR方法假陽性（PCR方法既能檢測活病毒，又 能檢測失活病毒)，檢測結果更準確。
[0020] (6)本發明三對引物的RT-PCR反應條件完全相同，可同時檢測幾種不同毒株的效 價，大大節省了時間成本，降低了對試驗設備的要求，且使用普通PCR儀即可，不需使用梯 度PCR儀。
[0021] (7)本發明PCR方法既有通用引物，能用于區分傳支病毒和其它禽類病毒；又有特 異性引物，能用于雞傳染性支氣管炎病毒分型鑒定。
【附圖說明】
[0022] 圖1第一組接毒72h時PCR凝膠電泳圖； 圖2第一組接毒144h時PCR凝膠電泳圖； 圖3引物對2的PCR凝膠電泳圖； 圖4引物對3的PCR凝膠電泳圖； 圖5第一組引物對1的PCR凝膠電泳圖； 圖6第一組引物對2的PCR凝膠電泳圖； 圖7第一組引物對3的PCR凝膠電泳圖； 圖8引物對1特異性試驗PCR凝膠電泳圖； 圖9引物對2特異性試驗PCR凝膠電泳圖； 圖10引物對3特異性試驗PCR凝膠電泳圖。
[0023] 圖1~圖4坐標中標號：M為DL2000 Marker