一種抗癌藥物的篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物篩選技術領域，具體涉及一種采用原位鄰位連接技術篩選能夠破 壞Hsp90和Cdc37相互作用的抗癌藥物的方法。
【背景技術】
[0002] 鄰位連接技術（proximity ligation assay, PLA)是一項高度特異和靈敏的蛋白 質分析技術。能夠檢測蛋白質表達水平、蛋白質之間的相互作用和蛋白質的轉錄后修飾(如 磷酸化修飾)，已經被應用于一系列的生物研宄系統中。該方法通過兩個分別特異性針對目 標蛋白的抗體識別復合物中的兩個相互作用的蛋白。這種方法通過在種屬性抗體上修飾單 鏈DNA寡核苷酸，形成鄰位探針，識別針對目的蛋白的特異性抗體。如果這兩個特異性抗體 結合的抗原相互作用，可以使兩對相對應的種屬性抗體連接的DNA也在空間上靠近，可以 和隨后加入的兩條連接DNA共同形成一個DNA環，作為滾環復制（RCA)的模板，并通過滾環 復制形成大量的連續單鏈DNA。這時，加入一個修飾有熒光標記的DNA短序列，它能夠雜交 到環上，大量的單熒光信號堆積，在顯微鏡下可以觀察到一個個點，這就是能夠直接觀測到 相互作用的兩個蛋白質分子在細胞中的定位。而傳統的免疫熒光只能夠對兩個蛋白質共定 位。原位PLA技術檢測操作簡單，并且可以建立劑量響應曲線，根據曲線計算蛋白間親和能 力(半數最高抑制濃度，IC50 )。PLA技術作為一項新的蛋白質分析工具，可以檢測蛋白水平、 蛋白間的相互作用、蛋白的翻譯后修飾水平的變化，具有很高的特異性和靈敏度，可以用于 炎癥、腫瘤疾病等病理生理過程研宄，甚至可用于細胞表面蛋白功能狀態的觀察，以及病毒 和細菌等感染因子的檢測，在基礎研宄和疾病診斷等研宄領域中具有重大意義。
[0003] 熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs)也稱作應激蛋白，是一系列高度保守且 功能強大的分子伴侶，其中Hsp90占細胞總蛋白量的1%-2%，主要包括3個結構域，（1)N端 結構域，約25kDa，包括與蛋白ATP酶活性相關的腺嘌呤結合區；（2)中間結構域，約35kDa， 能夠與其他分子伴侶以及其他蛋白發生結合的區域；（3)C端結構域，約10kDa，含有MEEVE 序列，能夠和一些含TPR結構域的共分子伴侶結合，也可形成自身的二聚化。蛋白質HSP90 在大量的細胞過程、進化和疾病中都扮演著重要的角色。正常情況下，它能夠防止蛋白錯誤 折疊發生聚集，能夠調節細胞在壓力/非壓力狀態下的生命活力，能夠與凋亡效應因子相 互作用抗凋亡。Hsp90的底物蛋白多是細胞內信號轉導通路的關鍵蛋白成分，與腫瘤的發 生、發展密切相關，這些蛋白質的過表達或過度激活是腫瘤發生發展中重要的標志。Hsp90 本身在許多癌細胞中也會過量表達，使腫瘤細胞相比于正常細胞，更能適應惡劣環境。
[0004] 在眾多的Hsp90的輔助伴侶分子中，細胞分裂周期蛋白（cell division cycle protein，Cdc) Cdc37可以特異性地輔助Hsp90和多種蛋白激酶的結合，Hsp90和Cdc37的 相互作用是Hsp90和底物蛋白相互結合所必須的。人的Cdc37蛋白可以分成C端結構域， 中間結構域和N端結構域，其中C端結構域對于Cdc37與Hsp90的相互作用至關重要，而N 端結構域主要負責和激酶等底物蛋白的催化結構域結合。而在癌癥細胞中，Hsp90和Cdc37 的表達量明顯上調。如Cdc37在正常前列腺上皮細胞中不表達，而在前列腺腫瘤中高度表 達。許多的HSP90客戶都是致癌蛋白激酶，Hsp90/Cdc37復合物在致癌蛋白激酶的成熟和活 性調節中起到關鍵的作用，當過度激活時這些蛋白可以導致癌癥。目前研宄發現，Cdc37可 以將一些底物蛋白運輸至Hsp90復合物，在Hsp90的作用下這些蛋白正確折疊，以及正常功 能的行使。當敲掉Cdc37時，Hsp90的一些與細胞增殖、細胞周期調節、細胞凋亡以及重要 信號通路相關的底物蛋白的表達水平會有明顯的下降，這使得這一復合物成為非常重要的 癌癥治療的潛在靶點。當前在臨床試驗中已有20種小分子Hsp90抑制劑用于抗腫瘤研宄。 本發明中提出的原位鄰位連接技術在細胞水平進行高通量藥物篩選，尋找能夠破壞Hsp90 和Cdc37相互作用的小分子化合物。
【發明內容】
[0005] 本發明所解決的技術問題是：提供一種采用鄰位連接技術在細胞水平篩選破壞 Hsp90和Cdc37相互作用藥物的方法，這種藥物可以應用到抗癌治療。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是： 提供一種抗癌藥物的篩選方法，該方法的具體步驟如下： I將抗小鼠IgG抗體和抗兔IgG抗體的N端修飾NHS基團后，分別與5'端修飾有疊 氮基團的單鏈Arml (SEQIDNO:l)、Arm 2 (SEQIDNO:2)偶聯，形成探針1、探針2; II培養Panel胰腺癌細胞株，將待篩選的藥物分別加入已貼壁的細胞培養容器中，形 成不同藥物處理實驗組，并設置沒有加任何藥物的對照組； III藥物作用結束后，加入特異性針對Hsp90的兔抗以及特異性針對Cdc37的鼠抗，后 加入步驟I中制備的探針1和探針2與上述兔抗和鼠抗進行反應； 1￥反應結束后，加入長單鏈連接〇嫩(3￡〇10勵:3)和短單鏈連接0嫩(3￡〇10勵:4)， 連接反應緩沖液以及T4連接酶進行連接反應反應，然后加入DNA聚合酶及反應緩沖液，進 行滾環復制反應，結束后加入熒光檢測單鏈DNA(SEQIDNO:5)以及細胞核染料DNA雜交及 單熒光信號堆積，最后在普通熒光顯微鏡下觀察； V以對照組為參照，篩選出熒光信號減少的實驗組，該組別所加藥物即為所需抗癌藥 物。
[0007] 其中，步驟11中Panel胰腺癌細胞株培養于24孔板中，細胞密度為2X 105個/每 孔，所加待篩選的藥物的濃度為10 UM，加入藥物后37°C作用1小時，而藥物作用后的細胞 可固定于玻片上，而步驟1：[1中，加入特異性針對Hsp90的兔抗以及特異性針對Cdc37的鼠 抗的反應條件為：4°C過夜。步驟IV中加入長單鏈連接DNA(SEQ ID N0:3)和短單鏈連接 DNA(SEQ ID N0:4)，連接反應緩沖液以及T4連接酶進行連接反應的反應條件為：37°C反應 30min，加入DNA聚合酶及反應緩沖液進行滾環復制反應的反應條件是：37°C反應90min。
[0008] 本發明的有益效果是：本發明首次將原位鄰位連接技術應用于抗癌藥物的篩選， 這種高通量的藥物篩選方法能夠在單細胞水平準確定位和定量Hsp90和Cdc37的相互作 用，精確反映其相互作用的變化，在接近體內的環境進行藥物篩選，靈敏度高，不存在自熒 光的干擾，在抗癌藥物制備方面具備廣闊前景。
【附圖說明】
[0009] 圖1:抗癌藥物篩選流程的模式圖 圖2:利用鄰位連接技術篩選能夠破壞Hsp90和Cdc37相互作用的藥物統計圖 圖3 :雷公藤紅素處理胰腺癌細胞株Panel后熒光顯微鏡下的成像圖，其中雷公藤紅素 處理后點數明顯的減少
【具體實施方式】
[0010] 下面將結合說明書附圖，對本發明作進一步的說明。
[0011] 本發明應用合成鄰位連接技術所需要的偶聯DNA、連接DNA、及檢測引物。首先通 過化學鍵在兩種種屬性抗體上偶聯兩個探針DNA，并與另外兩條DNA -起孵育雜交成環，通 過滾環復制將DNA信號不斷擴大，再加入帶熒光標記的檢測引物，將蛋白質相互作用的信 號轉換成在顯微鏡下可觀察到的熒光信號。下面以最近已發現的一種能夠破壞Hsp90和 Ccd37相互作用的小分子化合物一雷公藤紅素為例，系統介紹基于原位鄰位連接技術在 新型藥物篩選方面的應用。
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