啟動子優化的慢病毒基因修飾t細胞在腫瘤治療中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于利用慢病毒技術基因修飾T及NK細胞并使之獲得穩定的特異性抗腫 瘤能力的一種基因修飾技術，屬于第四代特異性抗腫瘤免疫治療技術，是近年來腫瘤免疫 治療技術的一個熱點，在腫瘤治療（包括白血病）上取得了突破性進展（Lee，Kochenderfer et al. 2014, Maude, Frey et al. 2014) 〇
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是最為嚴重危害人類健康的疾病，每年中國大約三百萬人被診斷為新 發腫瘤患者，二百萬人死于癌癥。盡管可以通過手術、放療、化療進行治療，但大多數病人 不能承受治療毒副作用和治療效率，仍死于腫瘤的復發和轉移。所以，如何清除殘留的微 小腫瘤組織或腫瘤細胞則是現代腫瘤免疫學有待解決的問題之一。由于癌癥發生的根本原 因是腫瘤細胞逃逸免疫細胞的監控而進行無節制的生長，所以提高免疫系統識別和殺傷腫 瘤細胞將從可以根本上去除腫瘤。目前，免疫療法是國際公認的最有希望完全消滅腫瘤細 胞的第四大新的治療方法。"癌癥免疫療法"被美國《科學》雜志評為2013年最大的科學突 破。免疫療法逐漸成為治療癌癥最有效的方法之一。
[0003] 同西方發達國家正在澎湃發展的第四代腫瘤特異性免疫治療技術相比，我國目前 的免疫治療還停留在第二代和第三代非特異性免疫治療階段。第四代免疫技術的主要技術 依托是基因修飾技術，目前，我國基因修飾技術同西方發達國家相比嚴重滯后，缺乏可以提 供基因工程病毒載體制備的服務機構及技術支持，更缺乏相關法規來指導臨床的應用。令 人欣喜的是，我國對腫瘤免疫治療非常重視，也有越來越多的科研院所，企業投入人力，資 金加入該鄰域的研發及臨床應用；但是，缺乏基因修飾手段成了制約免疫細胞治療升級換 代的首要因素。
[0004] 目前國際上最流行的可以穩定整合免疫細胞的病毒載體是LENTIVIRALVECTOR (慢 病毒載體體系），已在歐美發達國家進行了大量的臨床試驗，是公認安全，高效基因轉導系 統。如前所述，以抗腫瘤TCR及CAR T技術為代表的基因修飾技術給腫瘤的治療帶來了嶄 新的方法學，并引發了腫瘤治療史上的重大突破，2013年更被多家權威雜志列為年度科技 突破。其所需要的基因修飾既由該基因修飾載體來完成，已經進行了大量的人體實驗，其中 有的實驗治療者已經平安的度過了 20余年，沒有發現任何毒副作用。
[0005] 本發明所應用的慢病毒屬于最新一代載體系統，由四個功能組分構成，最大程度 地降低了其重組的可能性。在改造的慢病毒體系中，為了有效地表達目的基因，需要加入 一個有效的啟動子，其功能是啟動目的基因在宿主細胞內表達。目前，比較流行的啟動子 是 CMV (Human cytomegalovirus)UBC (Ubiquitin)、PGK(phosphoglycerate kinase-1)、 EF1 (elongation factor-lalpha)等，但它們在T及NK細胞內的表達不夠持久、效率低、容 易被甲基化從而失去功能。
【發明內容】
[0006] 本發明為解決現有技術中的上述問題而提出的。本發明系統地比較了不同的啟動 子，并進行了優化性構建，篩選出了最適合在人類T及NK細胞內表達的MSCV啟動子（鼠干 細胞病毒啟動子），該啟動子比較其它啟動子具有高效，穩定長期表達的優越性，是一種非 常有臨床應用前景的基因修飾體系。另外，為了達到高效均衡地表達抗腫瘤受體（TCR)的 兩條鏈（a和0)，該發明亦優化了病毒來源的2A結構，既優化地構建了 Furin+SGSG+2A 鏈接體，最大化地并均衡地表達抗腫瘤TCR的兩條鏈，經基因修飾的T細胞可以特異性識別 表達特異性抗原的腫瘤細胞，并高效率、特異性地殺傷腫瘤，實現了抗腫瘤效果的最大化。
[0007] 鑒于基因修飾的T細胞表達的抗腫瘤TCR存在主要組織相容性復合體限制 性（MHC)的問題，既一種抗腫瘤TCR只能應用到一類特定的人群（Morgan, Dudley et al. 2006)，發明人進一步應用該啟動子優化的慢病毒表達載體基因修飾T、NK細胞，使之表 達CAR的結構，并證實經基因修飾的T、NK細胞可以特異性地識別表達相應腫瘤抗原的靶細 胞，包括腫瘤細胞。
[0008] 本發明主要包括：
[0009] 1.優化慢病毒啟動子，比較了 MSCV，PGK，UBC等啟動子在原代T細胞及NK細胞 上的表達效率，實驗證實MSCV啟動子優化的慢病毒體系是基因修飾T、NK細胞的最佳方案 (見圖1-2);
[0010] 2.優化構建表達TCR兩條鏈的2A鏈接體，并在T細胞表面高效表達，同時可以特 異性識別并有效殺傷表達相應抗原的腫瘤細胞（見圖3-6);
[0011] 3. MSCV啟動子優化的慢病毒體系可以在T細胞高效表達抗腫瘤嵌合性抗原受體 (CAR)，并可以特異性識別表達相應靶點的腫瘤細胞（見圖7-9);
[0012] 4. MSCV啟動子優化的慢病毒體系可以高效基因修飾NK細胞（見圖10)。
[0013] 本發明提供了一種抗腫瘤T細胞及其制備方法。
[0014] 本發明還提供了一種以上述抗腫瘤T細胞為活性成分的抗腫瘤藥物。
[0015] 為實現上述目的，本發明采用以下技術方案：
[0016] 本發明的第一個方面是提供一種抗腫瘤T細胞，其特征在于，所述抗腫瘤T細胞是 以啟動子優化的慢病毒表達載體基因修飾T及NK細胞表達抗腫瘤TCR和抗腫瘤CAR來實 現的。
[0017] 在上述抗腫瘤T細胞中，所述T及NK細胞來自人類的外周血單個核淋巴細胞。
[0018] 本發明的第二個方面是提供如上述抗腫瘤T細胞的制備方法，包括如下步驟：
[0019] 步驟1、包涵抗腫瘤TCR和抗腫瘤CAR的啟動子優化的慢病毒載體的制備：通過 基因克隆，把TCR和CAR克隆到以MSCV為啟動子的慢病毒的多克隆位點，應用第四代慢病 毒的四個包裝質粒，通過轉染293FT細胞包裝成具有一次轉導能力的基因工程載體來實現 的；
[0020] 步驟2、T及NK細胞的轉導：將步驟1得到的包涵TCR和CAR的基因工程載體轉 導體外培養的T及NK細胞。T細胞的轉導：T細胞經抗一⑶3/⑶28磁珠激活并過夜培養， 然后滴加包涵TCR的載體，連續培養14天，期間按細胞生長情況分瓶及補充新鮮液體；包涵 CAR的載體轉導T細胞與上述方法相同，但T細胞的激活采取可溶性抗一 CD3抗體，其目的 是達到最大的感染效率。NK細胞通過抗CD56磁珠分選后，應用包含CAR的基因工程載體轉 導NK細胞，并加入KT64 (K562基因修飾的細胞株）進行擴增。
[0021] 步驟3、將步驟2所得到的T及NK細胞經過14天的體外培養，得到如權利要求1 所述的抗腫瘤T細胞。
[0022] 本發明的第三個方面是提供一種抗腫瘤藥物，所述抗腫瘤藥物以權利要求1所述 的抗腫瘤T細胞為活性成分。
[0023] 在上述抗腫瘤藥物中，優選地，所述抗腫瘤藥物為藥劑。
[0024] 在上述抗腫瘤藥物中，優選地，所述腫瘤包括例如黑色素瘤、乳腺癌、肺癌。
【附圖說明】
[0025] 圖1改造后的慢病毒表達載體系統結構示意圖。第四代慢病毒載體的結構如圖所 示，該載體兩末端的LTR經過基因工程改造，既改造成失活LTR，大大地增加了其安全性。啟 動子標識包括了 MSCV，PGK及UBC，啟動子之后的序列為綠色熒光蛋白（GFP)。
[0026] 圖2如圖1所示的裝有GFP的慢病毒轉導T細胞。兩例來自PBMC的T細胞體外 經抗CD3抗體活化后，應用上述病毒基因修飾T細胞，3天后，利用流式細胞儀檢測GFP在T 細胞的熒光強度，流式檢測結果顯示啟動子的表達活性MSCV>PGK>UBC。
[0027] 圖3利用MSCV慢病毒載體構建含自我剪切2A肽、弗林蛋白酶切點（furin)及間隔 序列（SGSG)的TCR表達載體結構示意圖。如圖所示，慢病毒載體經過MSCV啟動子的優化 改造，順式連接TCR的a鏈、furin酶的切點、間隔序列（SGSG)、F2A的2A肽和TCR的鏈，信 號終止由Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element(WPRE) 來實現。
[0028] 圖4流式細胞儀檢測TCR a和0鏈基因在⑶4、⑶8T淋巴細胞中的表達。⑶4和 ⑶8T細胞通過磁珠技術分離，然后利用抗-⑶3/⑶28的磁珠激活分離的T細胞，1天后，用 圖3所示的慢病毒載體分別轉導CD8、CD4T細胞；轉導7天后，應用流式細胞儀通過TCR對 應多肽的四聚體（Tetramer)檢測TCR的表達水平。
[0029] 圖5TCR修飾的CD4、CD8T與靶細胞共培養后，利用ELISA方法檢測上清中IFN- y 水平。TCR基因修飾后CD4、CD8T細胞與表達相關抗原的腫瘤細胞共培養，16小時后，收集 上清，并用ELISA試劑盒檢測IFN-y的水平。數據來源于三個復孔的平均值。其中，624、 526為表達MHC I A2分子的相關抗原，為陽性靶點細胞；888、938腫瘤細胞不表達MHC A2 分子，為陰性對照細胞。
[0030] 圖6經TCR修飾的⑶4、⑶8T淋巴細胞針對靶細胞殺傷活性的檢測。TCR基因修 飾的CD4、CD8T細胞與51Cr-標記的腫瘤細胞共培養四小時，效應細胞與靶細胞的比例如圖 所示，收集細胞，應用同位素檢測儀測定細胞中51Cr的含量，按照以下公式計算各組T細胞 腫瘤殺傷活性：腫瘤細胞殺傷百分比=(實驗組-淋巴細胞對照組）八最大裂解組-靶細 胞對照組）X100%。實際殺傷百分率如圖Y軸所示。其中，624、526為表達MHC I A2分子 的相關抗原，為陽性靶點細胞；888、938腫瘤細胞不表達MHC A2分子，為陰性對照細胞。
[0031] 圖7利用MSCV慢病毒載體構建的CAR表達載體結構示意圖。嵌合抗原受體（CAR) 順式連接到MSCV優化的慢病毒載體的多克隆位點。該CAR可以識別表達Her2/neu的腫瘤 細胞。
[0032] 圖8啟動子優化后的慢病毒載體在T細胞上高效表達CAR。PBMC經30ng/ml的可 容性抗-CD3抗體激活，第二天，應用表達CAR的慢病毒載體轉導T細胞，培養七天后，應用 流式細胞儀檢測CAR的表達水平。Mock代表對照組，4D5-CD8為表達針對Her2/neu CAR， 4D5-⑶16a為沒有活化信號的對照，GFP為轉導對照。
[0033] 圖9CAR修飾后的T細胞特異性識別表達Her2/neu的腫瘤細胞。轉導的細胞與腫 瘤細胞共培養，16小時后收集上清，應用ELISA檢測IFN的水平。CEM、MDA468為Her2/neu 表達陰性腫瘤；MDA231、HBT-77為Her2/neu表達陽性腫瘤。
[0034] 圖10重組慢病毒轉導NK細胞后，利用流式細胞儀檢測GFP在NK細胞的熒光強度， 流式檢測結果顯示啟動子的表達活性MSCV>PGK>UBC。
【具體實施方式】
[0035] 下述實施例中所用的方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見： ((Molecular Cloning:A Laboratory Manual)) (Sambrook, J. , Russell, David ff., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, N