特異性識別β-葡萄糖醛酸苷酶的核酸適配體序列及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，針對葡萄糖醛酸苷酶的核酸適配體。公開的核酸 適配體有希望能夠實現3-葡萄糖醛酸苷酶的純化和固定化的應用。
【背景技術】
[0002] 3 -葡萄糖醛酸苷酶是一種糖苷類水解酶，能催化各種類型的3 -葡萄糖醛酸苷 水解，在動物體內參與廣泛的代謝過程從而維持機體正常的生理活動，臨床上可作為腫瘤 治療中靶向前藥的水解酶，另外還被廣泛用于水質檢測、體內代謝藥物分析、天然產物的生 物催化轉化等領域。特別是作為催化劑應用于生物轉化甘草酸生產甘草次酸和單葡萄糖醛 酸基甘草次酸過程中，克服了傳統化學法的反應條件苛刻，選擇性差，產物收益率低，污染 環境等缺陷。3 -葡萄糖醛酸苷酶作為生物催化轉化甘草酸的關鍵酶，已受到越來越多的關 注，具有廣闊的應用和開發前景。固定化葡萄糖醛酸苷酶使工業用葡萄糖醛酸苷 酶的穩定性提高并延長了 葡萄糖醛酸苷酶的使用壽命。因此葡萄糖醛酸苷酶的固 定化受到了較為廣泛的關注。
[0003] 酶的固定化方法主要有吸附法，共價偶聯法，交叉法和包埋法等。但是，大量研究 表明這些固定化方法會一定程度上降低固定化酶的活性，主要原因為固定化酶的空間位阻 的存在阻礙底物與葡萄糖醛酸苷酶的活性位點的結合。另外，酶通過多位點與載體的 無序結合改變其活性構象，從而造成酶活的損失。基于以上考慮，利用酶的特定位點和特定 的材料及工藝將酶定向固定化到載體上，維持了酶的活性位點的穩定的構象，利于和底物 結合與反應，能顯著提高固定化酶的活性和使用效率。同時，生物相容性差也是引起葡 萄糖醛酸苷酶的變性和活力的下降的原因，具有良好的生物相容性的載體能夠為0-葡萄 糖醛酸苷酶創造適宜的微環境。
[0004]核酸適配體是一種經體外篩選技術得到的寡核苷酸序列ONA/RNA)，與相應的靶 分子具有嚴格的識別能力和高度的親和力。目前，核酸適配體的主要通過SELEX技術體外 篩選獲得，其核心是模擬自然進化過程，通過寡核苷酸間的堿基相互作用形成穩定的二級 結構（凸環、發卡、假節、G-四聯體等）與靶分子的特異性結合，利用寡核苷酸文庫與靶分 子親和力的不同，進行多輪的篩選，最終獲得與靶分子高親和力和高特異性結合的寡核苷 酸序列。目前已被成功的應用于氨基酸、多肽、蛋白質、有機化合物、金屬離子、細胞等快速 檢測。與抗體等多肽類的適配體相比，核酸適配體的優勢相當明顯，如：制備簡單快捷、化學 性質穩定、至今未見報道存在免疫原性或毒性、靶分子范圍廣、親和力高、特異性強、易于進 行改造修飾，同時具有良好的生物相容性特點等優點。
[0005] 目前，針對葡萄糖醛酸苷酶，尚無關于與其具有高特異性和高親和力的核酸 適配體及其制備方法和和應用的研究報道。因此本發明通過篩選獲得對葡萄糖醛酸苷 酶的特異性核酸適配體，實現葡萄糖醛酸苷酶的定向純化和固定化，提高葡萄糖醛 酸苷酶的使用效率，降低使用成本，具有重要的社會價值。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一組葡萄糖醛酸苷酶核酸適配體序列，具體涉及一種 3 -葡萄糖醛酸苷酶PGUS-E的核酸適配體中具有高親和力和高特異性結合PGUS-E。
[0007] 本發明中，所述的0 -葡萄糖醛酸苷酶為0 -葡萄糖醛酸苷酶P⑶S-E。
[0008] 本發明采用核酸適配體序列的體外篩選（SELEX)技術，以葡萄糖醛酸苷酶 PGUS-E為篩選靶標，篩選與PGUS-E特異結合的核酸適配體，獲得具有特異結合PGUS-E的核 酸適配體Apt5和Apt9。
[0009] 本發明通過下述技術方案實現：
[0010] 采用改進的核酸適配體的體外篩選技術即SELEX技術，以0 -葡萄糖醛酸苷酶 PGUS-E為篩選靶標，從體外合成的隨機寡核苷酸文庫5'-AGCAGCACAGAGGTCAGATGNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCCTATGCGTGCTACCGTGAA-3, ) %PGUS-E 特異性結合的核酸適配體；將篩選出的核酸適配體序列用引物Apt-F(5'-AGCAGCACAGAG GTCAGATG-3'）和Apt-R(5' -ITCACGGTAGCACGCATAGG-3'）進行PCR擴增并進行TA克隆 與PMD19-T載體（大連寶生物公司），轉化ToplO細菌（北京博邁德生物公司）；通過 PMD19-T載體通用引物M13F(-47) :(5' -CGCCAGGGmTCCCAGTCACGAC-3'）和M13R(-48): (5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3'）進行菌落PCR擴增篩選陽性克隆，將陽性克隆菌落培 養后送北京金維智生物公司測序。
[0011] 通過測序獲得的核酸適配體對P⑶S-E進行純化固定化測定，將生物素修飾的核 苷酸適配體與鏈霉素修飾的磁珠共價連接，進行核苷酸適配體與P⑶S-E的特異性捕捉和 固定化測定。
【附圖說明】
[0012] 圖1為本發明所涉及的基于SELEX技術的核酸適配體的篩選流程圖。
[0013] 圖2為本發明核酸適配體固定化P⑶S-E的穩定性對比圖。圖中（?)表示Apt5 固定化P⑶S-E，（ )表示Apt9固定化P⑶S-E。
【具體實施方式】
[0014] 實施例1 : 0 -葡萄糖醛酸苷酶P⑶S-E的制備
[0015] 將含有質粒pET-28a-GUS/BL21 (DE3)菌株接種于30ml的LB(卡那霉素Kanamycin 50yg/ml)，37 °C過夜制備種子液，以1/100的接種量轉接于500ml的新鮮的LB(卡那霉 素Kanamycin50iig/ml)培養基中，在37°C條件下培養直至0D6(i(i=~0. 6時，加入異丙 基-1-硫代-D-半乳糖吡喃糖苷（0. 5mM)，16°C條件誘導5小時。誘導后的菌體4°C， 12000轉/分鐘，離心10分鐘，棄上清收集菌體，菌體重懸于蛋白破碎緩沖液洗滌，4°C， 12000轉/分鐘，離心10分鐘。最后將菌體重懸于20ml蛋白緩沖液中，冰浴中超聲破碎。 超聲破碎后的菌液4°C，12000轉/分鐘，離心20分鐘，收集上清，獲得粗酶液。
[0016] P-葡萄糖醛酸苷酶P⑶S-E的純化。粗酶液利用AKTApurifaction系統進行平 衡、裝載，再平衡，然后用蛋白洗脫液洗脫蛋白并收集洗脫液，洗脫蛋白的緩沖液各組分如 下：50mMTris-HCl，300mmol/LNaCl，pH8.0其中咪唑濃度為25mM。將鎳柱洗脫收集的目標 蛋白稀釋，鹽離子濃度控制在50mM以下裝載到強陰離子柱SoucerQ200,控制鹽離子濃度 洗脫目標