一種從茶組織中提取總rna的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于核糖核酸（RNA)技術領域，具體涉及一種專門針對茶樹總RNA的提取 方法，適于于茶樹高質量總RNA的提取應用。
【背景技術】
[0002] 茶是中國重要的飲食文化的組成部分。關于茶的分子研宄有助于對茶的品質改 良，可以促進和提高人民的生活質量。然而相對于其他作物例如水稻，關于茶的分子研宄 就相當落后。這種滯后，主要原因之一是茶的DNA和RNA提取困難，尤其是茶總RNA的提 取特別困難。由于茶樹的種子和茶葉富含多糖、多酚、油脂等許多次生代謝物，嚴重影響了 從茶葉和茶種子中提取高質量總RNA。現有技術中所有對茶總RNA提取方法的報道均發現 茶總RNA很難提取。雖然有個別關于茶RNA的提取方法報道，但是未見任何對于所報道方 法后續的大量應用。據報道改良的CTAB法可以提取茶樹的總RNA，需要的時間2-3小時 (Muoki，Pauletal. 2012)。有報道用trizol提取茶種子中的總RNA，但是產量很低（林 萍，曹永慶etal.2011;李娜娜，陸建良etal.2012;Zhou，Linetal.2013)。與此類似， 國外的報道顯示trizol提取茶樹中的RNA不行（Muoki,Pauletal. 2012)。由于使用中需 要反復更換離心管，并且往往需要大體積離心管，所以不管是CTAB還是trizol提取中都容 易導致污染和RNA的降解。相比之下，柱式提取茶總RNA的技術快速，無污染。但是目前還 沒有利用柱式提取茶總RNA的技術。以前的報道中嘗試過用柱式法提取茶總RNA，卻未能成 功（Muoki,Pauletal. 2012)。
【發明內容】
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[0003] 本發明的目的在于針對現有技術存在的上述不足之處，提供一種快速穩定的茶樹 高質量總RNA的提取方法。本發明采用多種商業柱式RNA提取試劑盒對中國的六個茶品種 的組織進行了總RNA提取方法的系統研宄。通過悉心鉆研和反復調整，研發了一種用商業 柱式RNA提取試劑盒快速從茶組織中提取高質量總RNA的方法。本發明的方法可以短時間 內成功地提取了茶樹的嫩葉，老葉和種子的高質量總RNA并且成功地應用于下一代的高通 量的轉錄組測序。
[0004] 為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：
[0005] 一種從茶組織中提取高質量總RNA的方法，該方法包括試劑盒設備提取前處理， 提取步驟，質量檢測。
[0006] 如所述的一種從茶組織中提取高質量總RNA的方法，其中所述的試劑盒設備提取 前處理包括：
[0007] 提取前將用到的所有離心管，藥勺和研缽用0. 1 %DEPC純凈水浸泡12小時，鋁泊 紙包裹滅菌和干燥；
[0008] 提取前用RNAaseZAP噴霧離心機、試驗臺、試管架、移液器，1分鐘后用無菌紙巾拭 干。
[0009] 如所述的一種從茶組織中提取高質量總RNA的方法，其中所述的試劑盒設備提取 前處理過程中的操作人員需帶口罩和一次性無粉手套，用RNAaseZAP噴霧手套并拭干，使 用中適時更換新手套。
[0010] 如所述的一種從茶組織中提取高質量總RNA的方法，其中所述的提取步驟如下：
[0011] 將茶樹新鮮或者液氮冷凍的葉子、種子在完全預冷并裝有液氮的研缽中迅速研成 粉末，將1. 5ml或2ml經液氮預冷過的自備離心管置于已預冷過的試管架上，將粉末迅速轉 移至該離心管中，轉移的量為0.2-0. 3ml/管，加入700ylSL，立即劇烈漩渦混勻，增加振 蕩時間2-5min;
[0012] 將上一步的離心管至于離心機，12000rpm(~13,400Xg)離心2min后，取出置于 試管架；
[0013] 將離心以后的上清液倒入至過濾柱CS上，12000rpm(~13, 400Xg)離心2min，用 200y1移液器小心吸取收集管中的上清至新的1. 5ml自備離心管中；
[0014] 用200y1移液器緩緩加入0. 4倍上清體積的無水乙醇，立即蓋緊管蓋，上下顛倒 離心管，充分混勻，用1000y1移液器迅速將得到的溶液和沉淀一起轉移到吸附柱CR3中， 將吸附柱CR3放回收集管中；12000rpm(~13,400Xg)離心15sec，倒掉收集管中的廢液， 將吸附柱CR3放回收集管中；
[0015]向吸附柱中加入 150-280y1 去蛋白液RW1，，放置 2min，12000rpm(~13, 400Xg) 離心15sec,倒掉收集管中廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；
[0016] 重復上一步驟1次；
[0017]DNaseI工作液的配制：取10y1DNaseI儲存液放入新的RNase-Free離心管中， 加入70y1RDD溶液，輕輕混勻，向吸附柱CR3中央加入80y1DNaseI工作液，室溫放置 15min；
[0018] 向吸附柱CR3中加入250-350y1去蛋白液RW1，12000rpm(~13, 400Xg)離心 15sec，倒掉收集管中廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；
[0019]向吸附柱CR3中加入500y1漂洗液RW(使用前檢查是否已加入乙醇）， 12000rpm(~13, 400Xg)離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中；
[0020] 重復上一步驟1次；
[0021] 12000rpm(~13, 400Xg)離心2min，將吸附柱CR3放入一個新的1.5ml自備離心 管中，向吸附膜中央部位懸空滴加50y1RNase-FreeddH20,室溫放置2min，12000rpm(~ 13, 400Xg)離心lmin，得到RNA溶液，置于冰上待測或儲藏于-20°冰箱暫存，長時間保存 需置于-80°冰箱。
[0022] 根據所述的一種從茶組織中提取高質量總RNA的方法，其中所述的研磨過程要保 證材料不能解凍，研磨后在轉移前加入更多的液氮至粉末中使粉末保持冷凍，若茶樹種子 在液氮中冷凍過后較為堅硬，此種情況可用研缽棒先將其砸碎為細小顆粒再行研磨。
[0023] 根據所述的一種從茶組織中提取高質量總RNA的方法，其中所述的試劑SL使用前 務必加入0 _巰基乙醇至終濃度5% -10% ;如不能及時加入SL，要將裝有粉末的離心管置 于液氮中保存；若有多管材料，離心管要置于試管架。
[0024] 根據所述的一種從茶組織中提取高質量總RNA的方法，其中所述的過濾柱CS要放 在收集管中，收集上清至新的離心管時要盡量避免吸取上層油類及下層細胞碎片沉淀，并 記下轉移的上清總體積的數值ul。
[0025] 按照所述的一種從茶組織中提取高質量總RNA的方法，其中所述的試劑RW1的體 積范圍為150-280y1。
[0026] 按照所述的一種從茶組織中提取高質量總RNA的方法，其中所述的加ddH20的體 積和溫度范圍為：50ylRNase-FreeddH20,預先加熱至40-50°C。
【附圖說明】：
[0027] 圖1.為碧香早茶芽葉Nanodrop檢測RNA質量峰圖；
[0028] 圖2.為碧香早茶芽葉和種子RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】：
[0029] 下面結合附圖，用本發明實施例來進一步說明本發明的實施方式，但并不以此來 限定本發明。
[0030] 實施例1
[0031] 提取碧香早芽葉和種子總RNA方法概述：
[0032] 發明的內容包括所需試劑盒設備，提取前專有處理過程，提取操作步驟和所提的 RNA質量檢測四部分。具體實施方案如下：
[0033] 所需試劑和設備
[0034] RNAaseZAP，DEPC，無水乙醇，0 -巰基乙醇，液氮，
[0035] 離心管，試管架，藥勺，研缽，滅菌鍋，鋁泊紙，無菌紙巾，200ul移液器，lOOOul移 液器，200ul帶過濾器的槍頭，1000ul帶過濾器的槍頭
[0036] 1.提取前專有處理過程
[0037] 1. 1提取前將用到的所有離心管，藥勺和研缽用0. 1%DEPC純凈水浸泡12小時， 鋁泊紙包裹滅菌和干燥。
[0038] 1. 2提取前用RNAaseZAP噴霧所用到設備離心機、試驗臺、試管架和移液器，等待1 分鐘后用無菌紙巾拭干。提取中操作人員帶口罩和一次性無粉手套，用RNAaseZAP噴霧手 套并拭干。
[0039] 2?提取步驟
[0040] 2. 1.將80-120mg茶樹新鮮或者液氮冷凍的葉子、種子等組織材料在完全預冷并 裝有液氮的研缽中迅速研成粉末，研磨過程保證材料不能解凍。研磨以后在轉移前可以再 加入更多的液氮至粉末中使粉末保持冷凍（新加到研缽中的液氮一般可以堅持3-5分鐘）。 茶樹種子在液氮中冷凍過后較為堅硬，此種情況可用研缽棒先將其砸碎為細小顆粒再行研 磨。將1.5ml或2ml經液氮預冷過的自備離心管置于已預冷過的試管架上。用液氮冷凍的 藥勺將粉末迅速轉移至該1. 5ml或2ml離心管中，轉移的量為0. 2-0. 3ml/管，加入700y1 SL(使用前務必加入0 -巰基乙醇至終濃度5% -10% )，立即劇烈漩渦混勻，可適當增加振 蕩時間2-5min。如不能及時加入SL，將裝有粉末的離心管置于液氮中保存。若有多管材料， 離心管可以暫時至于試管架。粉末轉移的量為0. 2-0. 3ml/管，適用解決了用量無法在液氮 情況下稱量的問題和保證了RNA產量。
[0041] 2. 2?將上一步的離心管至于離心機，12000rpm(~13, 400Xg)離心2min。離心以 后，將離心管取出至于試管架。
[0042] 2. 3.小心地將離心以后的上清液倒入至過濾柱CS上（過濾柱放在收集管中）， 12000rpm(~13, 400Xg)離心2min，用200y1移液器小心吸取收集管中的上清至新的 1. 5ml自備離心管中，盡量避免吸取上層油類及下層細胞碎片沉淀。記下轉移的上清總體積 的數值（ul)。
[0043] 2. 4.用200y1移液器緩緩加入0. 4倍上清體積的無水乙醇，立即蓋緊管蓋，上下 顛倒離心管，充分混勻，用1000y1移液器迅速將得到的溶液和沉淀一起轉移到吸附柱CR3 中，將吸附柱CR3放回收集管中。12000rpm(~13,400Xg)離心15sec,倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱CR3放回收集管中。若有多管材料，將收集管至于試管架。
[0044] 2. 5.向吸附柱中加入150-280y1去蛋白液RW1，，放置2min，12000rpm(~ 13,400Xg)離心15sec,倒掉收集管中廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0045] 2. 6?重復步驟2. 5-次。
[0046] 2. 7.DNaseI工作液的配制：取10ulDNaseI儲存液放入新的RNase-Free離心 管中，加入70y1RDD溶液，輕輕混勻。向吸附柱CR3中央加入80ylDNaseI工作液，室溫 放置15min。
[0047] 2.8.向吸附柱〇?3中加入250-350 111去蛋白液咖1，12000印111(~13,400\§)離 心15sec，倒掉收集管中廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0048] 2.9.向吸附柱CR3中加入500yl漂洗液RW(使用前檢查是否已加入乙醇）， 12000rpm(~13, 400Xg)離心15sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CR3放回收集管中。
[0049] 2. 10?重復步驟