一種利用拉氏圖信息制備谷氨酸脫羧酶突變體的方法及其突變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種利用拉氏圖信息制備谷氨酸脫羧 酶突變體的方法及其突變體。
【背景技術】
[0002] 定點突變（site-directedmutagenesis或site-specificmutagenesis)是指在 目的DNA片段的指定位點上引入特定的堿基對變化的技術，是重組DNA進化的基礎，該方法 通過改變基因特定位點核苷酸序列來改變所編碼的氨基酸序列，常用于研宄某個（些）氨 基酸殘基對蛋白質結構、催化活性以及結合配體能力的影響，也可用于改造DNA調控元件 特征序列，修飾表達載體，引入新的酶切位點等。特別是在酶的理性設計中，或者利用隨即 突變等定向進化技術篩選得到具有潛力的重要氨基酸殘基位點后，進行定點突變分析，將 有利于更好的了解該位點在蛋白質結構和功能的關系中所發揮的作用。
[0003]谷氨酸脫羧酶（glutamatedecarboxylase，簡稱GAD;EOi. 1. 1. 15)是一種廣泛地 存在于植物、動物和微生物中的氨基酸脫羧酶，它可以專一地催化L-谷氨酸的a-羧基脫 羧反應生成y-氨基丁酸（y-aminobutyricacid，簡稱GABA)。GABA是哺乳動物中樞神經 系統的一種關鍵的抑制性神經遞質，具有抑制中樞神經系統過度興奮、解除神經緊張等生 理功能。GABA對人體具有鎮靜安神、促進睡眠、健腦益智、降低血壓、改善免疫功能、延緩衰 老等作用，是一種在食品和醫藥領域具有廣泛應用的天然氨基酸，已被國家衛生部批準為 "新資源食品"。
[0004] 目前，利用谷氨酸脫羧酶或具有該酶活力的細胞進行GABA的高效生物合成正得 到越來越多的重視。在工業生產中，往往希望提高反應速率，從而提高生物催化與轉化的效 率。GAD作為制備和生產GABA的關鍵酶，提高其催化活性有利于其在大規模生物反應器中 的應用。
[0005] 中國專利ZL200510049189. 4和中國專利ZL200510049187. 5公開了一種生產 氨基丁酸的短乳桿菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 1306,對該菌株的GAD基因進 行克隆，構建重組質粒，轉化到大腸桿菌（Escherichiacoli)BL21(DE3)中，可實現該基因 的可溶表達。但是，該基因表達的GAD比活力不高，不利于該酶在GABA生物制備中的應用。
【發明內容】
[0006] 本發明提供了一種利用拉氏圖信息制備谷氨酸脫羧酶突變體的方法及其突變體， 該方法可有效提高突變的概率，節省時間，提高實驗效率，采用該方法獲得的突變體具有較 高的酶活，可顯著提高反應速率。
[0007] -種谷氨酸脫羧酶突變體的制備方法，包括：
[0008] (1)構建谷氨酸脫羧酶的三維結構模型，進行二面角合理性評價，生成拉氏圖，從 拉氏圖中確定處于構象不合理區的氨基酸殘基位點；
[0009] (2)針對所述處于構象不合理區的氨基酸殘基位點設計定點突變引物，以谷氨酸 脫羧酶基因為模板，進行定點PCR擴增，純化后，轉化至宿主細胞，獲得定點突變文庫；
[0010] (3)從所述定點突變文庫中篩選谷氨酸脫羧酶突變體。
[0011] 其中，具體地，構建谷氨酸脫羧酶三維結構模型的程序為MODELLER和Swiss Model;進行二面角合理性評價的程序為PROCHECK。
[0012] 該方法通過MODELLER和SwissModel兩個程序構建谷氨酸脫羧酶的三維結構 模型，再利用PR0CHECK程序進行該酶的二面角合理性評價，生成拉氏圖（Ramachandran Plot)，拉氏圖中的每個區域的顏色從深到淺排列的次序依次為最佳合理區、額外合理區、 一般合理區和不合理區，從不合理區中找到構象不合理的氨基酸殘基位點。
[0013] 具體地，所述谷氨酸脫羧酶為短乳桿菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 1306 的谷氨酸脫羧酶GAD1407。該谷氨酸脫羧酶GAD1407在拉氏圖中處于構象不合理區的氨基 酸殘基位點為413位點，該位點的氨基酸為賴氨酸。
[0014] 本發明采用上述方法得到了一個谷氨酸脫羧酶突變體，該突變體的氨基酸序列如 SEQIDNO. 2所示。該突變體的編碼基因的堿基序列如SEQIDNO. 1所示。
[0015] 本發明通過對谷氨酸脫羧酶GAD1407基因中對應413氨基酸殘基位點的堿基進行 定點突變將原編碼賴氨酸的堿基序列AAA替換為ATT，編碼的氨基酸為異亮氨酸，獲得PCR 擴增片段，純化后，轉化至宿主細胞，獲得定點突變的菌株文庫，然后，將該文庫中的菌株進 行谷氨酸脫羧酶的表達與純化，獲得的突變酶分別置于20°C和55°C條件下處理，將55°C處 理后的比活力對比20°C處理后的比活力，得到殘余活力比值，將突變酶的該比值與野生型 酶的殘余活力比值進行比較篩選出活力高的突變酶，即谷氨酸脫羧酶突變體K413I。
[0016] 本發明還提供了一種包含所述編碼基因的谷氨酸脫羧酶表達單元、重組質粒以及 轉化子。
[0017] 表達單元的啟動子可以為常用的17啟動子、lac啟動子或araBAD啟動子。在這 些啟動子的作用下，谷氨酸脫羧酶的突變酶可以直接在大腸桿菌宿主細胞中實現胞內可溶 表達。
[0018] 本發明還提供了所述谷氨酸脫羧酶突變體在催化L-谷氨酸或其鈉鹽生成Y-氨 基丁酸中的應用。
[0019] 與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：
[0020] 本發明方法通過拉氏圖提供的結構信息對酶進行理性設計，并結合定點突變技 術，有效提高突變概率，節省時間，提高實驗效率，并篩選得到催化活力優于野生型酶的突 變酶，該突變酶的比活力是野生型酶的1. 6倍，可提高催化L-谷氨酸或其鈉鹽生成Y-氨 基丁酸的反應速率，有利于GABA的工業化生產，利于廣泛推廣。
【附圖說明】
[0021] 圖1為質粒pET28a(+)_gad的基因圖譜；
[0022] 圖2為MODELLER(左）和SwissModel(右）模建結果的拉氏圖；
[0023] 圖3為突變位點K413在GAD三級結構中的位置圖（以球表示）；
[0024] 圖4為定點突變原理不意圖；
[0025] 圖5為野生型GAD酶基因PCR擴增產物凝膠電泳圖譜；
[0026] 圖6為突變酶和野生型GAD在pH4. 8條件下的比活力。
【具體實施方式】
[0027] 為進一步說明本發明，結合以下實例進行具體說明：
[0028] 本發明研宄的基礎是來自短乳桿菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 1306中 的GAD基因。其中短乳桿菌（Lactobacillusbrevis)CGMCCNO. 1306已在中國專利申請 200510049189. 4和中國專利申請200510049187. 5中公開，由浙江大學保藏在中國普通微 生物保藏管理中心（地址：北京市朝陽區北辰西路1號院）。本申請使用的菌株由浙江大 學饋贈。
[0029] 表達宿主菌E.coliBL21 (DE3)為浙江大學生物工程研宄所保藏； pET28a(+)-GAD1407重組質粒由浙江大學保存；FastDigestDpnI限制酶、EasyPfu DNA聚合酶購自FermentasInternationalInc.Canada;FastPfuDNA聚合酶、Ni-NTA agarose層析介質購自北京全式金生物技術有限公司；質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑 盒、DNAMarker、異丙基-0-D-硫代半乳糖苷（IPTG)購自生工生物工程（上海）股份有限 公司。種子培養基為LB培養基，表達培養基為TB培養基，均含有50yg/mL卡那霉素。
[0030] 本發明通過MODELLER和SwissModel構建GAD的三維結構模型，利用PR0CHECK 程序進行二面角合理性的評價，生成拉氏圖（RamachandranPlot)(如圖2所示）。根據拉 氏圖氨基酸殘基位點K413位于構象不合理區（如圖3所示），采用定點PCR方法對GAD基 因K413位點進行定點突變，獲得一種谷氨酸脫羧酶活力提高的突變體。定點突變原理的 示意圖，如圖4所示。該突變體進過測序證實其基因為K413I，其核苷酸序列在第413位密 碼子處發生突變，由編碼賴氨酸（Lys)的密碼子AAA突變為編碼異亮氨酸（lie)的密碼子 ATT。研宄發現，此位點密碼子突變后得到的變體基因編碼的谷氨酸脫羧酶