用食用菌菌棒生產木質素酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及木質素酶的生產方法，尤其涉及一種以食用菌菌棒為原料生產木質素酶的方法。
技術背景
[0002]木質素酶(Lignin-degrading enzymes)，是能夠催化木質素氧化降解的一組酶的總稱，包括漆酶(簡稱Lac)、錳過氧化物酶(簡稱Mnp)和木質素過氧化物酶(簡稱Lip)。漆酶即系統名為本二酚氧化還原酶，作用與鄰酮醇和對酮醇，氨基苯酚和本二胺的氧化反應；錳過氧化物酶即系統名為二價錳過氧化氫氧化還原酶，催化二價錳氧化成三價錳的反應；木質素過氧化物酶即系統名為木質素過氧化氫氧化還原酶，催化木質素的氧化反應。研宄發現，它們對許多含有芳香結構的化合物如多環芳烴、酚類、氯代芳香化合物、染料、農藥等污染物都有較強的降解能力，這是由于食用菌分泌產生的木質素降解酶系底物的非專一性決定的。并且降解酶系為胞外分泌，從而更加容易接觸這些待降解物。這種特殊的降解機制在環境保護、飼料工業、化學工業和煤炭化學方面展現了巨大的應用前景，已經引起了學術界和工業界的廣泛關注。
[0003]目前木質素酶的生產大多采用液態深層發酵生產，技術要求苛刻，能耗高，酶活低并且還會產生大量的生產廢水，對環境產生不良影響。近年來，各國研宄人員逐漸開始用固態發酵技術生產木質素酶，它可模仿天然微生物的生長過程，生產人們需要的產品，但由于產木質素酶的微生物一般都是絲狀真菌，生長速度較慢，故生產周期較長。也有研宄報道直接從食用菌菌渣中提取木質素酶，但由于未加產酶誘導液培養的菌渣中木質素酶酶活較低，需要很高的分離純化成本，經濟效益較低，不利于大規模應用。
[0004]到目前為止，尚未見任何以食用菌菌棒為原料添加產酶誘導液進行二次培養生產木質素酶的技術。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種用食用菌菌棒生產木質素酶的方法，利用含有食用菌菌絲的菌棒為原料，使得農業生產中的菌棒得到高值化再利用，改善環境，降低木質素酶制取的成本。
[0006]菌棒是指以棉籽殼、木肩、稻草、玉米芯、甘蔗渣及多種農作物秸桿、工業廢料為主要原料，接種食用菌菌絲培養一段時間以后用來生產食用菌子實體或采收子實體以后剩下的棒狀固態混合物。食用菌菌絲在培養基中生長時，需要產生大量的木質素酶來分解基質中的木質纖維素以獲得營養。因此，收獲或者尚未收獲子實體的菌棒中含有大量的食用菌菌絲和木質纖維素。菌棒的具體組成不能作為對本發明所述木質素酶制備方法的限定。
[0007]工業廢料主要選自于醋糟、酒糟、造紙廠廢液。
[0008]食用菌為人工培養或野生環境下可為生物食用的菌類。其生長過程中能分泌木質素酶來分解基質中的木質纖維素以獲得營養。所述食用菌主要選自于蘑菇(Agaricuscampestris)、香葫(Lentinula edodes)、茶樹葫(Agrocybe aegerita)、猴頭葫(Hericiumerinaceum)、鳳尾葫(Pleurotus sajor-caju)、雙抱蘑葫(Agaricus bisporus)、木耳(Auricularia auricula)、冬蟲夏草(Cordyceps sinensis)、靈芝(Ganoderma lucidum)、血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)、金耳(Tremella aurantialba)、鮑魚葫(Pleurotusabalonus)、平葫(Pleurotus ostreatus)、金針葫(Flammulina velutipes)、杏鮑葫(Pleurotus eryngii)、秀珍葫(Pleurotus geesteranus)、雞腿葫(Coprinus comatus)、白靈葫(Pleurotus nebrodensis)、肺形側耳(Pleurotus pulmonarius)、姬松鸞(Agaricusblazei)等。
[0009]本發明提供了一種利用食用菌菌棒生產木質素酶的方法，具體包括如下步驟:菌棒的破碎處理得到菌糠；添加產酶誘導液；適宜條件下培養；粗酶液回收；多次添加誘導液產酶。
[0010]1.破碎菌棒得到菌糠
[0011]將已經或者尚未采收子實體的菌棒除去塑料袋以后，利用粉碎機將菌棒破碎得到均勻的菌糠。
[0012]2.添加誘導產酶液
[0013]所用誘導產酶液含有木質素酶的誘導物，其他物質能為食用菌菌絲提供氮元素和微量元素，此外還能調整體系的碳氮比(C/N)和pH值，刺激菌絲二次生長。誘導產酶液通過本實驗室長期反復試驗得到。
[0014]—種具體的實施方式，每1kg菌糠誘導產酶液的通常加入量為10-50L，可進一步選擇10-30L，當具體選擇12、13、15、16、17、19、20、23、25或28L時能更有效地刺激菌糠中食用菌菌絲的二次生長，誘導木質素酶的高效表達和分泌。
[0015]3.適宜條件下培養
[0016]合適的外界培養條件可以改變食用菌菌絲的生理狀態，更好地表達和分泌木質酶。
[0017]一種具體的實施方式，培養溫度通常為17-35°C，可進一步選擇為22-30°C，或具體選擇為22、24、25、27、28、30°C。在以上溫度條件下培養的時間為24-192小時，或進一步選擇24、72、96、120或144小時，可以得到木質素酶含量更高的菌糠。
[0018]4.粗酶液的回收
[0019]向步驟3得到的含有大量木質素酶的發酵熟成體系中加入1-20倍體積的蒸餾水浸泡，振蕩，過濾。可進一步選擇1-10，當具體選擇為1、3、5、7、9倍時能使菌絲分泌的木質素酶盡可能地溶解到溶液中又不傷害到菌絲。當蒸餾水體積過少得到的木質素酶總量就會過少，當蒸餾水體積過大，就會在洗脫過程中使菌絲受到損害。
[0020]5.多次添加產酶誘導液
[0021]向步驟3得到的菌糠交替重復步驟2添加產酶誘導液、步驟3適宜條件下培養、步驟4粗酶液的回收，共計1-6個周期，這樣做的目的是更高效地利用菌糠。重復次數過多以后由于菌絲的老化，產酶能力下降。
[0022]本發明提供了一種利用食用菌菌棒生產木質素酶的方法。是菌糠高值化利用的一種新途徑，是一種全新的木質素酶生產方法，與目前所有報道過的有關木質素酶生產方法相比，本發明省去了食用菌菌體生長過程，縮短了產酶時間，節約了能源和材料，是所有已經報道過的有關木質素酶生產方法中成本最低的。因此，利用廢棄菌糠制備木質素酶，既可以做到廢物利用改善環境，又可以降低木質素酶的生產成本，具有很好的應用前景。
【具體實施方式】
[0023]以下結合實例詳細描述本發明的技術方案。實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應