抗人脂聯素的單克隆抗體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于免疫學和生物技術領域，涉及抗人脂聯素的單克隆抗體及其應用，更 具體地，涉及利用抗人脂聯素的單克隆抗體制備的人總脂聯素酶聯免疫吸附分析（ELISA) 試劑盒及其大批量檢測樣本的臨床應用。
【背景技術】
[0002] 人脂聯素（Adiponectin,又名apMl,Arcp-30,AdipoQ,GBP-28)是由apMl基因編 碼，由244個氨基酸殘基構成的蛋白分子，具有與膠原VIII、膠原X、補體Clq和TNF-a同 源的結構域。人脂聯素主要在脂肪細胞特異表達和分泌，是血液中含量最豐富的細胞因 子，約占總血漿蛋白的0.01%，循環中的脂聯素以多聚體形式存在，包括高分子量（high molecularweight，HMW, 12-18聚體及更高）的主要形式、中分子的六聚體（hexameric middlemolecularweight，MMW)和少量的低分子三聚體（trimericlowmolecular weight，LMW)形式。不同形式的脂聯素功能有所不同。
[0003] 大量實驗表明，脂聯素具有廣闊應用前景。脂聯素可通過不同的途徑作用于多個 器官，在一些重要的生理過程中發揮關鍵的調控作用，包括糖脂代謝、造血、炎癥、補體激 活、血栓形成以及抗腫瘤細胞生長等，其分泌失調與許多疾病的發生、發展密切相關。基因 掃描將2型糖尿病、代謝綜合征和冠心病的易感基因均定位于3q27,正是脂聯素基因所在 區域，脂聯素基因突變引起的低脂聯素血癥與上述疾病發生密切相關。一些抗糖尿病藥物 如噻唑烷二酮類更是把增加脂聯素的表達作為2型糖尿病改善胰島素抵抗的治療靶點。臨 床研宄也顯示，對于肥胖患者尤其是伴胰島素抵抗者，脂聯素表達水平顯著降低，體重減輕 后表達上調，并伴隨胰島素敏感性提升，因此，脂聯素可作為反映脂肪組織內分泌功能變化 的重要標志物，不僅可以區分具有不同健康風險的肥胖亞型，還可作為減重效果評價的重 要指標。對于2型糖尿病患者，血中脂聯素濃度顯著降低，并且降低的程度與與胰島素抵抗 及糖尿病的進展相平行，可望成為評判2型糖尿病代謝狀況的新指標。大量的流行病學證 據還顯示，脂聯素水平降低可以預測2型糖尿病、代謝綜合征、冠心病以及某些腫瘤的患病 風險。因此檢測脂聯素水平對于上述疾病的早期預測、治療監控以及預后判斷都具有重要 參考價值。除血液以外，新近臨床研宄還發現唾液、尿液、關節液以及乳汁等樣本中的脂聯 素水平也具有不同的檢查價值和病理生理意義，從而進一步拓展了脂聯素水平檢測的臨床 意義和發展潛力。
[0004] 目前，檢測脂聯素的定量方法主要有采用多克隆抗體的競爭性放射免疫分析方法 (RIA)和雙抗體夾心分析模式的酶聯免疫吸附方法（ELISA)。ELISA方法靈敏度高，特異 性強，標記試劑穩定，無RIA方法的放射污染和危害，因此應用廣泛。但現有試劑盒大都受 限于關鍵試劑如檢測抗體不能自己生產，不僅價格昂貴，且質量和穩定性難以長期保障；有 的試劑盒還受限于使用多克隆抗體，多抗供量有限且批間差異大，這樣的試劑盒難以適應 大批量長時期開展前瞻性臨床研宄的需要；同時，由于循環中存在不同聚合形式的脂聯素， 不同方法采用的抗體性質不同，特別是采用多克隆抗體，結合位點不同，與不同聚合形式的 結合能力也不同，因此準確測定各種形式的總脂聯素的濃度有很大難度；此外，大多試劑盒 用途單一，沒有完整考察是否適用于包括血清/漿、唾液、關節液、乳汁和細胞培養上清等 各類生物樣本的大批量檢測，也沒有詳細考察能否檢測包括多種分子形式脂聯素的總體水 平。
【發明內容】
[0005] 因此，為了解決現有技術的不足，本發明的目的是提供一種抗人脂聯素單克隆抗 體，該抗人脂聯素單克隆抗體能結合各種分子形式的脂聯素，且質地均一、穩定性好、可長 期大批量生產；本發明還提供了一種操作簡便、靈敏度高、成本低、經大樣本臨床和流行病 學驗證，可適用于大批量檢測血清/漿、唾液、關節液、尿液及細胞培養上清等各種生物樣 本中人總脂聯素水平的ELISA試劑盒。此外，本發明的抗人脂聯素單克隆抗體還可用于免 疫組化、免疫印跡等多種免疫檢測用途。
[0006] -方面，本發明提供了一種雜交瘤細胞株，所述雜交瘤細胞株為6C3-I或C2001， 其中，
[0007] 雜交瘤細胞株6C3-I的保藏號為CGMCCNo. 9908 (分類命名：人脂聯素單克隆抗 體雜交瘤細胞株，保藏日期：2014年11月03日，保藏號為CGMCCNo. 9908,保藏地：中國院 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中 國科學院微生物研宄所，郵編：1〇〇1〇1);
[0008] 雜交瘤細胞株C2001的保藏號為CGMCCNo. 9568 (分類命名：人脂聯素單克隆抗體 雜交瘤細胞株，保藏日期：2014年08月18日，保藏號為CGMCCNo. 9568,保藏地：中國院微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國 科學院微生物研宄所，郵編：100101)。
[0009] 另一方面，本發明提供一種抗人脂聯素單克隆抗體A25或C63,其中，所述抗人脂 聯素單克隆抗體A25由保藏號為CGMCCNo. 9568的雜交瘤細胞株C2001產生；
[0010] 所述抗人脂聯素單克隆抗體C63由保藏號為CGMCCNo. 9908的雜交瘤細胞株 6C3-I產生。
[0011] 本發明的抗人脂聯素單克隆抗體通過以下步驟制備：
[0012] 1)制備抗人脂聯素單克隆抗體雜交瘤細胞株；
[0013] 2)檢測單克隆抗體；
[0014] 3)將雜交瘤的克隆化及擴大培養；
[0015] 4)大量生產、純化和鑒定單克隆抗體的性質。
[0016] 再一方面，本發明提供一種使用本發明的抗人脂聯素單克隆抗體在生物樣本中定 量和/或定性檢測人脂聯素分子中的應用，優選地，所述人脂聯素分子為人總脂聯素分子， 優選地，所述人總脂聯素分子為不同聚合形式的人脂聯素分子，進一步優選地，所述人總脂 聯素分子的聚合形式為低分子的三聚體、中分子六聚體和高分子12-18聚體或更高聚體。 優選地，所述生物樣本為血清/漿、唾液、腦脊液、關節液、乳汁以及組織細胞提取液或細胞 培養上清等含有脂聯素的生物學液體樣本。
[0017] 優選地，所述檢測的方法為半定量的非變性凝膠電泳免疫印跡法或定量的ELISA 法但不限于ELISA。使用半定量的非變性凝膠電泳免疫印跡法時，將本發明的單克隆抗體用 于混合人血清經非變性凝膠電泳分離后，使用免疫印跡法檢測，發現本發明不同的單克隆 抗體具有不同的結合能力，從而可以分辨出不同聚合形式的人脂聯素。
[0018] 優選地，所述方法為ELISA方法，該方法包括以下步驟：
[0019] (1)進行夾心結合試驗，在單克隆抗體A25和C63中選擇最佳配對單克隆抗體； [0020] (2)將兩種單克隆抗體中的一種作為固相抗體，使用酶標板包被，另一種作為標記 抗體，使用生物素標記；
[0021] (3)加入酶標親和素，檢測被結合的標記；
[0022] 優選地，所述ELISA方法中，使用單克隆抗體C63作為包被抗體，A25作為標記抗 體。
[0023] 在上述方法中，待測樣品可以為血清/漿、唾液、腦脊液、關節液、乳汁以及組織細 胞提取液或細胞培養上清等含有脂聯素的生物學液體樣本。
[0024] 還一方面，本發明提供一種抗人脂聯素單克隆抗體在組織/細胞中檢測人脂聯素 蛋白表達的應用，優選地，所述方法為免疫組化法；優選地，所述樣本為培養的細胞或組織 活檢樣本。
[0025] 本發明還提供了一種人總脂聯素的檢測試劑盒，所述試劑盒中包含本發明所述的 抗人脂聯素單克隆抗體作為有效成分，優選地，所述檢測試劑盒為ELISA試劑盒，更優選 地，所述ELISA試劑盒中的ELISA采用雙抗體夾心的非競爭結合法，進一步優選地，所述 ELISA中引入BA放大系統。
[0026] 優選地，所述ELISA試劑盒包括：
[0027] 用于捕獲待測樣品中的抗人脂聯素單克隆抗體C63 ;
[0028] 生物素標記的人脂聯素單克隆抗體A25 ;
[0029] 系列包含已知濃度的人脂聯素標準品溶液和質控品；
[0030] 酶標親和素；
[0031] 檢測酶標親和素的工具。
[0032] 優選地，所述試劑盒還包括包被液、磷酸鹽緩沖液、阻斷液、洗滌液、抗體稀釋液、 酶結合物稀釋液、底物應用液和/或終止液。
[0033] 優選地