一種新型神經干細胞培養添加劑及篩選方法、應用及利用該添加劑的培養基的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于細胞技術領域,涉及一種細胞培養添加劑,尤其是一種新型神經干細 胞培養添加劑及篩選方法、應用及利用該添加劑的培養基。
【背景技術】
[0002] 干細胞(stemcell)是身體內的原始未分化細胞,而神經干細胞(neuralstem cell,NSC)和神經前體(母)細胞(neuralprecursorcell,NPC,是初級分化的神經干細 胞)是神經系統的干細胞。因為其在治療神經系統疾病和損傷中的廣闊使用前景,近年來 的研宄和臨床應用突飛猛進地發展。而神經干系統應用最首要的是能夠在體外成功地培養 并獲得增殖神經干細胞。因為神經是機體中最復雜和最高度分化的組織,神經干細胞的培 養難度極高,在培養過程中極其容易自發分化,從而很快就失去干細胞的特性和功能。所以 培養基的優化是必須的,也是極為困難的。
[0003] 目前最簡單的神經干細胞培養基是在基礎培養基DMEM及DMEM/F12 (1:1)和堿性 成纖維細胞生長因子(bFGF),表皮生長因子(EGF)內加入N2培養添加劑。N2添加劑的成 分比較簡單,含有細胞生長所必需的0. 025暈克/毫升胰島素,0. 1暈克/毫升轉鐵蛋白以 及20微摩爾孕酮,100微摩爾腐胺,和30毫微摩爾亞硒酸鈉(BottensteinandSato)。但 是因為其中總蛋白含量低,而且缺乏一些細胞生長的需求物,因此不能完全滿足現有的神 經干細胞培養的使用需求。
[0004] 目前,解決N2培養添加劑存在的問題,最廣泛使用的是在上述神經干細胞培養 基的基礎上加入B27培養添加劑。但是,B27添加劑原本是為培養神經元設計的(Brewer etal.),其成分相當復雜,且包含皮質酮、視黃醇和三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3),這些成分 已被證明為會導致神經干細胞(neuralstemcell,NSC)和神經前體(母)細胞(neural precursorcell,NPC)分化的成分。還有一些B27成分并非神經干細胞所需的,或是已經 被N2所提供。
[0005] 其中,上述B27添加劑成分如下:生物素,左旋肉堿,膽固醇,皮質酮,乙醇胺, D(+) _半乳糖,谷胱甘肽,卵磷脂,亞油酸,亞麻酸,磷脂酰膽堿,孕酮,腐胺,視黃醇,視黃醇 乙酸酯,亞硒酸鈉,三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3),DL_a-維生素E,牛血清白蛋白,過氧化氫 酶,胰島素,超氧化物歧化酶,轉鐵蛋白。
[0006] 通過檢索,尚未發現與本發明專利申請相關的專利公開文獻。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于克服現有技術的不足之處,提供一種設計科學、配方簡單、成本 低廉、經濟合理,并能促進神經干細胞增殖而降低其向膠質細胞分化的新型神經干細胞培 養添加劑及篩選方法、應用及利用該添加劑的培養基。
[0008] 為了實現上述目的,本發明所采用的技術方案如下:
[0009] -種新型神經干細胞培養添加劑,其組成成分及最終使用濃度為:
[0010] 牛血清白蛋白1暈克/毫升,生物素50暈微克/毫升,左旋肉堿1微克/毫升,乙 醇胺〇. 5微克/毫升,D⑴-半乳糖7. 5微克/毫升,谷胱甘肽0. 1微摩爾和亞硒酸鈉30毫 微摩爾。
[0011] 利用如上所述的新型神經干細胞培養添加劑的培養基,所述培養基中添加新型神 經干細胞培養添加劑。
[0012] 而且,其組成成分及比例如下:
[0013] DMHM培養基和DMEM/F12培養基的合成培養基,其中DMHM和DMEM/F12的體積比 為 1:1 ;
[0014]N2培養添加劑,N2培養添加劑的成分和使用濃度:0. 025毫克/毫升胰島素,0. 1 毫克/毫升轉鐵蛋白,20微摩爾孕酮,100微摩爾腐胺和30毫微摩爾亞硒酸鈉;
[0015] 10暈微克/毫升堿性成纖維細胞生長因子和20暈微克/毫升表皮生長因子;
[0016] 以及上述新型神經干細胞培養添加劑。
[0017] 如上所述的新型神經干細胞培養添加劑在培養神經干細胞方面的應用。
[0018] 而且,所述神經干細胞為哺乳動物的神經干細胞。
[0019] -種如上所述的新型神經干細胞培養添加劑的篩選方法,步驟如下:
[0020] ⑴挑選B27培養添加劑中成分組成一個簡化培養添加劑配方,該配方的最終使用 濃度含有牛血清白蛋白1毫克/毫升,生物素50毫微克/毫升,左旋肉堿1微克/毫升,乙 醇胺〇. 5微克/毫升,D⑴-半乳糖7. 5微克/毫升,谷胱甘肽0. 1微摩爾和亞硒酸鈉30毫 微摩爾;然后在基本培養基的基礎上比較該簡化培養添加劑和B27培養添加劑對神經干細 胞生長的促進作用;之后再在簡化培養添加劑的基礎上逐個加入其它B27中成分以測定其 是否有添加效果;
[0021] ⑵細胞培養:
[0022] 1)解剖取材妊娠12. 5天和13. 5之間胚胎小鼠的大腦皮質(el2. 5-13. 5);
[0023] 2)DMEM洗滌培養后神經組織一次,在10單位/毫升木瓜蛋白酶和4毫克/毫升 DNA酶溶液中,37°C消化45分鐘;
[0024] 3)加入4毫克/毫升DNA酶后用吸管輕輕地吹打5-7次以分散組織;
[0025] 4)在1000轉/分鐘離心5分鐘,再懸浮于無鈣鎂的Hanks平衡鹽溶液中清洗;重 復三次后,將制成的單細胞懸液經臺盼藍染色后用血細胞計數儀測定細胞密度;
[0026] 5)按5X104/平方厘米的密度將細胞懸浮在含有新型簡化培養添加劑的神經干 細胞完全培養基中,接種于24孔培養板中;細胞培養板先涂覆過15毫微克/毫升多聚鳥 氨酸,然后是3毫微克/毫升的纖維連接蛋白;在37°C5%C02水套式二氧化碳培養箱里培 養;
[0027] 6)每兩天作總量四分之三培養基的換液,直至細胞長滿培養板時,一般需要6-7 天,即可用來進行3H_胸腺嘧啶核苷摻入法來測定小鼠神經干細胞增殖;
[0028] 7)為了用免疫細胞化學染色來決定培養中各種分化后細胞所占的比例,需要在細 胞長滿培養板時全部換用新鮮培養基并撤除堿性成纖維細胞生長因子和表皮生長因子以 促使干細胞分化成為神經元和膠質細胞;四天后用4%多聚甲醛固定之后作免疫細胞化學 染色;
[0029] ⑶3H_胸腺嘧啶核苷摻入法來測定小鼠神經干細胞增殖:
[0030] 首先向培養液中加入0. 5毫微居里/毫升3H-胸腺嘧啶核苷并孵育24小時;用 10%三氯乙酸沉淀細胞的DNA10分鐘,在室溫和10%三氯醋酸洗滌兩次后,用0. 2摩爾氫氧 化鈉在室溫下提取DNA樣品10分鐘,所述DNA樣品含4毫克%切碎的DNA;同液體閃爍液 混合后在液體閃爍計數儀上測量同位素放射量;
[0031] ⑷免疫細胞化學染色來決定培養中各種細胞的比例
[0032] 用4%多聚甲醛在室溫固定細胞培養25分鐘,用磷酸緩沖鹽水(PBS)洗滌三次; 對于細胞內抗原的染色,在〇. 1%TritonX-100中破細胞膜30分鐘,接著在5%正常山羊 血清孵育30分鐘以阻斷非特異性結合;在室溫孵育2小時;使用抗體是小鼠單克隆抗-微 管蛋白用于染神經元,1:750稀釋,兔多克隆抗GFAP用于染星形膠質細胞(1:400);小鼠單 克隆抗04用于染少突膠質細胞及其前體細胞(1:10);用PBS洗三次后,在生物素標記的羊 抗鼠IgG二抗中孵育1小時;用PBS洗三次后,在鏈霉親和素堿性磷酸酶溶液孵育30分鐘; 最后用底物BCIP/NBT顯示顏色;在倒置顯微鏡下觀察和計數;
[0033] 所述各種細胞的比例是細胞數量比;
[0034] (5)選取具有最強的促進神經干細胞增殖的簡化培養添加劑配方,即得新型神經干 細胞培養添加劑的篩選方法。
[0035] 而且,所述步驟中⑴中的基本培養基的組成是:DMEM和DMEM/F12(體積比為1:1) 合成培養基,加N2培養添加劑和10暈微克/毫升堿性成纖維細胞生長因子和20暈微克/ 毫升表皮生長因子;
[0036] 其中,所述N2培養添加劑按1:100體積比從商售濃縮液稀釋于合成培養基中。
[0037] 本發明的優點和積極效果是:
[0038] 1、本發明添加劑設計科學、配方簡單、成本低廉、經濟合理,并能促進神經干細胞 增殖而降低其向膠質細胞分化,該培養添加劑能夠應用在培養神經干細胞方面,包括人在 內的所有哺乳動物的神經干細胞和神經前體細胞的培養,使用范圍極為廣泛。
[0039] 2、本發明添加劑對神經干細胞培養時,在添加N2的基礎上,該培養添加劑具有最 強的促進神經干細胞增殖作用,細胞增殖比只有N2時高出30%,其效果優于復雜且昂貴的 B27(圖1)。相比之下B27比只有N2時只高出微不足道的5%,而且沒有顯著性差異;在N2 和該培養添加劑基礎上增加三碘-L-甲狀腺原氨酸(T3)或維生素E對神經干細胞生長有 抑制作用,而其他的B27成分包括皮質酮,視黃醇,脂酸,谷胱甘肽,過氧化氫酶+超氧化物 歧化酶(SOD)則無明顯的添加作用。這些結果證明N2加上簡化培養添加劑足以滿足神經 干細胞高度生長的需要,沒有必要添加其它的B27培養添加劑的成分,因此節約了成本。
[0040] 3、本發明添加劑對神經干細胞培養時,在N2的