胎盤底蛻膜間充質干細胞的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及間充質干細胞的制備，特別涉及一種胎盤底蛻膜間充質干細胞的制備方法。
【背景技術】
[0002]間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來源于發育早期中胚層和外胚層的一類多能干細胞，最初在骨髓中發現，因其具有以下特點:1)造血支持作用。作為造血微環境主要細胞成分一一基質細胞系的干/祖細胞，MSCs與造血干細胞共同移植可促進造血干祖細胞的植入；2)免疫調控。MSCs不表達⑶34，⑶45，HLA-DR等協同刺激分子，體外可抑制混合淋巴細胞反應，對于預防和治療異基因造血細胞移植后引起的移植物抗宿主病，治療自身免疫系統疾病有重要意義；3)基因治療，由于MSCs體外擴增、增殖能力強，可以作為基因操作的干細胞平臺，加之MSC具有對腫瘤的靶向性，在腫瘤的基因治療中有著十分誘人的前景；4)多向分化潛能。在體外特定的誘導條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經、肝、心肌、內皮等多種組織細胞，連續傳代培養和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細胞用于組織工程。
[0003]目前，從胎盤、臍帶獲得間充質干細胞常用酶消化法，通常是采用膠原酶消化2?3小時后加入胰酶，這種酶消化方法會因為消化不完全導致獲得間充質干細胞量少，沒有分離出的細胞被浪費，增大了細胞擴增的難度，延長了細胞培養時間。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種胎盤底蛻膜間充質干細胞的制備方法，能夠在很大程度上消化胎盤底蛻膜組織塊，進而能夠獲得大量間充質干細胞，增大底蛻膜組織塊利用率，縮短細胞培養時間。
[0005]為實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種胎盤底蛻膜間充質干細胞的制備方法，包括以下步驟:將I型膠原酶加入底蛻膜組織塊中消化18?20h后加入胰酶繼續消化，然后進行過濾和離心，獲得胎盤底蛻膜間充質干細胞；將獲得的胎盤底蛻膜間充質干細胞進行培養擴增。由此，I型膠原酶消化底蛻膜組織塊時間較長，能夠獲取大量間充質干細胞，增大底蛻膜組織塊利用率，縮短細胞培養時間及培養周期，避免了細胞因多次復制引起的細胞質量下降以及功能形態變化，為臨床使用胎盤底蛻膜間充質干細胞提供了良好的保障。
[0006]在一些實施方式中，I型膠原酶的加入量是底蛻膜組織塊體積的2倍。由此，I型膠原酶在此用量范圍內，能夠滿足較長的消化時間。
[0007]在一些實施方式中，胰酶的加入量是底蛻膜組織塊經I型膠原酶消化后總體積的0.2?0.3倍。由此，胰酶在此用量范圍內，能夠得到較好的消化效果。
[0008]在一些實施方式中，胰酶在37°C下消化20?40min。由此，在此時間范圍內胰酶對底蛻膜組織塊有較好的消化效果。
[0009]在一些實施方式中，底蛻膜組織塊經胰酶消化后加入總體積三倍量生理鹽水，然后經過200目篩網過濾，ISOOrpm離心lOmin，獲得沉淀細胞。可獲得含雜質較少的細胞。
[0010]在一些實施方式中，將生理鹽水加入所述沉淀細胞，1500rpm離心lOmin，獲得胎盤底蛻膜間充質干細胞。進一步清洗提純獲得基本不含雜質的胎盤底蛻膜間充質干細胞。
[0011]在一些實施方式中，將獲得的胎盤底蛻膜間充質干細胞以2 X 14個/cm2密度接種于培養瓶中，進行原代細胞培養。對間充質干細胞進行第一次增殖培養，以上述密度接種，能夠具有較好的增殖效果。
[0012]在一些實施方式中，將所述培養瓶置于37°C、飽和濕度、5%的0)2培養箱中進行原代細胞培養。在此環境下進行細胞培養，使細胞具有良好的增殖速度。
[0013]在一些實施方式中，原代細胞培養過程中，細胞培養到80?90%融合時，用含重量0.25% EDTA的胰酶消化，將原培養瓶中的培養基與細胞的混合物按1:2?1:5體積比接種到新培養瓶中培養，細胞再次培養到80?90%融合時，收集細胞。由此，依照上述步驟轉移至新培養瓶中進行細胞培養，能夠使細胞具有良好的增殖速度。
[0014]在一些實施方式中，培養擴增得到的胎盤底蛻膜間充質干細胞用于項目檢測或凍存。
[0015]本發明的有益效果為:本發明的制備方法采用I型膠原酶消化底蛻膜組織塊18?20h后，在加入胰酶繼續消化。I型膠原酶消化底蛻膜組織塊時間較長，能夠獲取大量間充質干細胞，增大底蛻膜組織塊利用率，縮短細胞培養時間及培養周期，避免了細胞因多次復制引起的細胞質量下降以及功能形態變化，為臨床使用胎盤底蛻膜間充質干細胞提供了良好的保障。
【附圖說明】
[0016]圖1為A組的組織貼壁法制備間充質干細胞中細胞培養第9天間充質干細胞形態圖；
[0017]圖2為A組的組織貼壁法制備間充質干細胞中細胞培養第15天間充質干細胞融合80%?90%形態圖；
[0018]圖3為B組的胰酶消化法制備間充質干細胞中細胞培養第20天間充質干細胞形態圖；
[0019]圖4為B組的胰酶消化法制備間充質干細胞中細胞培養第28天間充質干細胞融合80%?90%形態圖；
[0020]圖5為C組的胰酶加膠原酶直接消化法制備間充質干細胞中細胞培養第10天間充質干細胞形態圖；
[0021]圖6為C組的胰酶加膠原酶直接消化法制備間充質干細胞中細胞培養第22天間充質干細胞融合80%?90%形態圖；
[0022]圖7為D組本發明的制備間充質干細胞方法中細胞培養第3天間充質干細胞形態圖；
[0023]圖8為D組本發明的制備間充質干細胞方法中細胞培養第7天間充質干細胞融合80%?90%形態圖；
[0024]圖9為D組本發明的制備間充質干細胞方法中細胞培養生長曲線及對應的細胞活率圖；
[0025]圖10為D組本發明的制備間充質干細胞方法中細胞培養P2代間充質干細胞流式表型圖；
[0026]圖11為D組本發明的制備間充質干細胞方法獲得間充質干細胞的成骨誘導分化圖；
[0027]圖12為D組本發明的制備間充質干細胞方法獲得間充質干細胞的成軟骨誘導分化圖；
[0028]圖13為D組本發明的制備間充質干細胞方法獲得間充質干細胞的成脂肪誘導分化圖。
【具體實施方式】
[0029]以下通過對比幾種胎盤底蛻膜間充質干細胞的制備方法，進一步解釋本發明的有益效果。其中幾種胎盤底蛻膜間充質干細胞的制備方法包括組織塊貼壁法、胰酶消化法、胰酶加膠原酶直接消化法和本發明的制備方法。其中，I型膠原酶、胰酶、DMEM-F12培養基均采購自GIBCO公司。對比操作包括以下步驟:
[0030]S101、從新鮮足月胎盤組織中剝取底蛻膜，用生理鹽水對底蛻膜組織進行清洗。
[0031]S102、盡量瀝干底蛻膜組織表面的生理鹽水，在玻璃皿中剪碎為底蛻膜組織塊，組織塊的體積為Imm3左右，然后平均分成A、B、C、D4組。
[0032]S103、將A、B、C、D4組分別采用組織塊貼壁法、胰酶消化法、胰酶加膠原酶直接消化法和本發明的方法制備間充質干細胞。制備過程如下。
[0033]1、A組采用組織塊貼壁法制備間充質干細胞。
[0034]將A組的底蛻膜組織塊均勻貼于10mm的培養皿中，組織塊之間的距離在I?2cm，晾干貼壁40min后，每個培養皿中加入1mlDMEM完全培養基，置于37 °C、飽和濕度、5 %的0)2培養箱中進行原代細胞培養。
[0035]待細胞爬出后，剔除組織塊，繼續進行細胞培養，如圖1所示，為細胞培養第9天間充質干細胞形態圖。細胞培養到80?90%融合時，用含重量0.25% EDTA的胰酶消化，按
1:2?1:5接種到新培養瓶中培養。
[0036]如圖2所示，細胞培養第15天細胞再次培養到80?90%融合。此時收集細胞，取
2X 15個用于流式檢測；取5X 10 3個/cm2接種于培養孔板中，進行成骨、成脂肪、成軟骨誘導實驗；剩余細胞按2X 16個/ml永久凍存于液氮中。
[0037]2、B組采用胰酶消化法制備間充質干細胞。
[0038]將B組的底蛻膜組織塊放入15ml離心管中，且加入組織塊體積1/4的