一種胚胎干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發明公布了一種將胚胎干細胞定向誘導分化為肝細胞的有效方法，屬于再生醫 學技術領域。
【背景技術】
[0002] 我國是肝病大國，每年因終末期肝病死亡者人數眾多。目前，肝硬化、原發性肝癌、 代謝性肝病等終末期肝病的治療主要依賴于原位肝移植，原位肝移植仍然是治療終末期肝 病最有效的措施，但由于存在供肝嚴重短缺、免疫排斥和長期服用免疫抑制劑帶來多種毒 副作用等缺點，其臨床應用受到很大抑制。以肝細胞移植（Hepatocytetransplantation, HT)作為原位肝移植的替代治療是一種可用于治療肝臟疾病的可行方案，但亦面臨著肝細 胞資源缺乏、體外培養的肝細胞增殖能力差等缺點限制了其應用。干細胞的研究為解決上 述問題提供了新的思路。
[0003] 胚胎干細胞（embryonicstemcells,ESCs)因其具有無限的增殖能力和分化為 各個胚層細胞的潛能，是細胞替代治療臨床疾病理想的種源細胞。特別是ESCs分化為肝 細胞樣細胞（hepatocyte-likecells,HLCs)的研究，可為臨床細胞替代治療提供合適的 細胞來源，亦在藥物評估和肝臟發生等基礎研究方面起重要作用。目前國內外已報道了人 (Caietal, 2007;Lavonetal, 2004)和小鼠（Gouon-evansetal, 2006;Hamazaki etal，2001)ESCs體外分化為肝細胞或肝樣細胞的研究，這些分化的細胞在形態上與成 體肝細胞相似，并表達肝細胞相關的基因和蛋白，有些分化得到的細胞還具備肝細胞的功 能，這些研究為以ESCs為種源細胞進行肝細胞替代治療研究奠定了良好的基礎。
[0004] 近年來，ESCs的誘導分化已形成了多種方法和技術體系，其中以分化過程可分為： 1.胚胎干細胞自發分化；2.胚胎干細胞直接以誘導劑誘導期分化；3.胚胎干細胞先形成擬 胚體（EB)，之后將一個球形EB直接接種，再添加各種誘導劑來誘導分化。在他們的研究中， 主要通過4個階段的誘導實現ES細胞向功能性肝細胞的分化，即內胚層的誘導分化、肝特 異性細胞的誘導分化、成肝細胞的擴增和肝細胞的成熟。在這一過程中，每個階段所要依靠 的細胞因子各不相同，常用的早期誘導因子有激活素A、丁酸鈉SB等。激活素A可通過激 活activin/nodal信號通路誘導ESCs向內胚層分化。常用的中期誘導因子有HGF、FGF、 BMP、DMS0等。HGF可通過激活c-Jun通路促進肝臟發育。FGF家族中與肝臟發育相關的 主要因子有？6?2、？6?4、？6?7，來源于橫隔間充質的81^2和81^4可與？6?聯合誘導肝臟分 化。晚期促成熟因子主要包括0SM和地塞米松，前者通過gpl30信號轉導通路誘導肝臟成 熟，后者參與肝臟糖異生。
[0005] 人類ESCs可以自發形成擬胚體，然后自發分化為各種組織特異性細胞系，其中 10~30%分化成肝細胞和肝細胞樣細胞；通過富集擬胚體的內胚層，分化成肝細胞和肝細胞 樣細胞的效率增長到50~65% ;而目前在iPSC和ESC分化成肝細胞的過程中，持續添加各種 組織特異性生長因子，其分化效率可達60~80%，誘導過程所需時間太長，需要20天左右；而 縮短誘導時間，誘導效率則明顯下降。早期誘導因子丁酸鈉是一種細胞周期阻抑化合物(組 蛋白脫乙酰化酶抑制劑)，在誘導過程中會使細胞大量死亡，需要大量的hESCs才能誘導出 少量的肝細胞。目前，誘導成功的肝細胞盡管滿足了某些實驗的需求，但是，對于臨床要求 來講，還具有較大的距離。所以，如何在此基礎上進一步優化，也是近年來研究人員一直在 探討的問題。
[0006] 氧是細胞生存的必要條件之一，也是細胞生物學行為和生理功能的一種重要調節 因子。細胞在體外培養下的生存和生長也必須有適宜的氧濃度，細胞培養本身又是研究氧 生物學作用的重要方法。然而，多種細胞體外培養所需的最適氧濃度還不確定，不同氧濃 度對細胞的作用及其機制尚不完全清楚。細胞的類型和機能狀態、技術條件等因素都可 影響細胞對氧濃度變化的反應。人和哺乳動物細胞體外培養的氣相環境條件一般是恒溫 37°C，含5%~10%C02及飽和水蒸汽的空氣。在細胞培養實驗領域，人們普遍將標準C02 培養箱內空氣的〇2體積分數作為細胞培養氣相環境的正常或常規氧體積分數，簡稱常氧（ normoxia)，低于和高于常氧的氧濃度分別稱為低氧（hypoxia)和高氧（hyperoxia)。在 胚胎發育早期，由于宮腔內血管尚未生長進入，所有的胚胎細胞處于低氧濃度的生理微環 境（宮腔內氧含量為2%~5%)。低氧作為一種生理性的刺激因素，影響著胚胎干細胞的生 長、分化。目前，對ESCs的體外分化研究多在常氧(約20%)條件下進行，難以反映體內的真 實情況。
[0007] 所以，針對上述技術背景和技術存在的問題，本發明擬在經典分化方法的基礎上， 在細胞分化過程中，對細胞因子種類和作用模式進行優化，探索可以高效定向誘導胚胎干 細胞分化為成熟功能性肝細胞的方法，從而為研究肝細胞的發生發育和藥物篩選建立一種 新的體外模型，同時也為胚胎干細胞在臨床肝臟疾病的治療應用方面提供一定的理論基礎 和技術支持。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種高效的誘導胚胎干細胞分化為肝細胞的優化方法，大大 縮短了整個誘導分化所需的時間，且提高分化率。本發明是模擬宮腔內生理微環境，用低 氧條件（4% 02)預培養細胞，并運用P53聯合Wnt5a作為前期誘導劑，聯合肝細胞營養因子 aFGF、HGF、KGF、AFP等，通過類胚體EB途徑實現的。
[0009] 為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明是通過如下技術方案來實現 的： 一種胚胎干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法，包括以下步驟： 步驟1)胚胎干細胞的體外培養，培養體系為含20%胎牛血清的高糖DMEM培養基，其中 添加 0.1mmol/L2-巰基乙醇，25mMHEPES，100U/ml青霉素和 100ug/ml鏈霉素，1000 U/mL重組小鼠白血病抑制因子（LIF)，培養條件為常氧、5%C02、37°C; 步驟2)擬胚體的形成：培養體系為去除胚胎干細胞培養體系中的LIF，同時將胎牛血 清濃度調整為15%即可；將胚胎干細胞以3X104~5X104/ml濃度接種于未經過促細胞黏 附作用處理、瓶底光滑的玻璃培養瓶中搖動培養法，1天后便會有大量的擬胚體生成，形成 成熟擬胚體；將成熟的囊性擬胚體用胰蛋白酶消化為單個細胞，培養條件為常氧、5%C02、 37。。； 步驟3)誘導分化階段I:培養體系為誘導培養培養體系I，培養條件為低氧4% 02、5% C02、37°C，培養時間為2天； 步驟4)誘導分化階段II:培養體系為誘導培養培養體系II，培養條件為常氧、5%C02、 37°C，培養時間為3天； 步驟5)誘導分化階段III:培養體系為誘導培養培養體系III，培養條件為常氧、5%C02、 37°C，培養時間為3天； 步驟6)誘導分化階段IV:培養體系為誘導培養培養體系IV，培養條件為常氧、5%C02、 37°C，培養時間為2天。
[0010] 進一步的，所述的步驟3)中的誘導培養培養體系I為將胎牛血清濃度調整為10% 的擬胚體形成階段培養體系，并加入腫瘤抑制因子P53和腫瘤抑制因子Wnt5a制備而成。
[0011] 進一步的，所述的步驟4)中的誘導培養培養體系II為將胎牛血清濃度調整為10% 的擬胚體形成階段培養體系，并加入20ng/ml甲胎蛋白（AFP)，100ng/ml酸性纖維細胞生長 因子（aFGF)，30ng/ml人成纖維細胞生長因子4 (FGF4)制備而成。
[0012] 進一步的，所述的步驟5)中的誘導培養培養體系III為將胎牛血清濃度調整為 10%的擬胚體形成階段培養體系，并加入20ng/ml肝細胞生長因子（HGF)，10ng/ml制瘤素 (OSM)，20ng/ml角質細胞生長因子（KGF)制備而成。
[0013] 進一步的，所述的步驟6)中的誘導培養培養體系IV為將胎牛血清濃度調整為10% 的擬胚體形成階段培養體系，并加入1(T7M地塞米松（DEX)，0. 8%二甲基亞砜（DMSO)，5ug/ml 胰島素，5ug/ml轉鐵蛋白制備而成。
[0014] 進一步的，所述的誘導培養培養體系I中的腫瘤抑制因子P53的濃度范圍是 0. 5-lU/ml，優選0. 16U/ml;腫瘤抑制因子Wnt5a濃度范圍是50-200ng/ml，優選100ng/ml。
[0015] 本發明的主要優點在于： (1)本發明將成熟EB經消化成為單細胞后接種進行誘導培養，讓細胞與因子和胞外基 質能夠充分接觸，從而能有效地以及快捷地誘導出肝細胞。
[0016] (2)本發明運用低氧條件（4% 02)預培養細胞，模擬宮腔內生理微環境，促進ES細 胞向肝細胞的分化，肝細胞相關基因的表達提高20%，使分化細胞更接近于真正的肝細胞。
[0017] (3)本發明首次運用P53聯合Wnt5a作為前期誘導劑，避免誘導劑對干細胞本身的 傷害，加速胚胎干細胞向內胚層的分化。同時，細胞誘導中后期培養系統中選擇了采用促進 肝細胞發生及生長的細胞生長因子TGF、aFGF、HGF、KGF、AFP、胰島素等。細胞生長因子得 到更合理優化，大幅度的提高肝細胞分化率，肝細胞分化率為95%。
[0018] (4)本發明方法大大縮短了胚胎干細胞體外誘導分化為肝細胞的時間，整個分化 過程僅需13天。
[0019] (5)本發明方法條件易于控制，分化過程中便于形態觀察，操作簡單，成本低廉。
【附圖說明】
[0020] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本申請的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中： 圖1是本發明一種胚胎干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法的實驗流程圖； 圖2是本發明具體實施例中EB細胞在分化過程中的形態學變化結果（X100)。其中圖2A、圖2C、圖2E為低氧預培養組細胞在分化第1、3、9天的細胞形態；圖2B、圖2D、圖2F為 常氧對照組細胞在分化第1、3、9天的細胞形態； 圖3是本發明具體實施例中誘導第2、4、7、10天的兩組分化細胞的RT-PCR檢測結果； 圖4是本發明具體實施例中RealtimePCR分析肝細胞相關基因AFP、ALB、CK18在分 化過程的變化； 圖5是本發明具體實施例中免疫熒光化學染色結果（X200); 圖6是本發明具體實施例中誘導肝細胞糖原染色結果（X100); 圖7是本發明具體實施例中誘導肝細胞的ICG代謝能力評價結果（X100)，其中圖7A為導肝細胞吸收ICG的結果；圖7B為誘導肝細胞釋放ICG的結果。
【具體實施方式】
[0021] 以下將結合附圖，參照具體實施例詳細描述本發明，如圖1所示的本發明一種胚 胎干細胞定向誘導分化為肝細胞的方法的實驗流程圖，本發明可以按如下所述來選擇細胞 誘導培養所需試劑及器材： 1.ES細胞：選用的人源HIES細胞購自美國WiCell研究所； 2. 細胞培養試劑： ES細胞培養基：DMEM(glucose，4.5g/L)，20%胎牛血清，0?lmmol/L2-巰基