一種用于生產山羊痘疫苗的細胞株的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及疫苗的制備領域，更具體的講是一株用于生產山羊痘疫苗的細胞株 及生產該疫苗的方法。
【背景技術】
[0002] 山羊痘（Goatpox)和綿羊痘（Sheeppox)是分別由羊痘病毒屬（Capripoxvirus) 的山羊痘病毒和綿羊痘病毒引起的山羊、綿羊的痘病，自19世紀50年代開始流行，期間雖 然得到一定的控制，但仍然持續流行于非洲、中東、亞洲和歐洲的多個國家和地區，近幾年， 隨著全球氣候變化以及動物、動物產品貿易方式的改變，這兩種痘病的流行更加猖獗，是危 害經濟動物最嚴重的痘病。
[0003] 近年來該病在我國廣泛流行。病毒可以感染不同日齡的山羊和綿羊，以發熱、體 表或者內臟器官出現痘斑為特征，表現為皮膚型和內臟型兩種，嚴重影響羊的采食和生產 機能，甚至造成死亡，羔羊及新引種的羊感染后尤其具有很高的死亡率。預防綿羊痘和山羊 痘，應用最多的是弱毒疫苗和滅活疫苗，但是由于羊痘病毒感染動物的特殊抗原形式和免 疫應答方式，滅活疫苗免疫保護期短暫，出現免疫失敗幾率較高。
[0004] 我國研發的山羊痘細胞弱毒AV41株作為一種細胞弱毒，具有較好的免疫原性， 既能夠用于預防山羊痘病毒感染，又能夠有效預防綿羊痘病毒感染，已經在全國范圍內獲 得廣泛應用。但是到目前為止，國內進行山羊痘細胞弱毒AV41株生產的常用細胞仍然是原 代綿羊羔睪丸細胞，需要采用4月齡以內雄性羔綿羊，無菌摘取睪丸組織，經過剝離包膜、 剪碎、消化、分散等工藝制成。由于制備細胞需要大量新鮮組織，而羔羊組織的無菌摘取要 求復雜、組織中細胞數量有限、羔羊成本較高，嚴重限制了山羊痘疫苗的批生產產量。為擴 大生產用細胞范圍，降低成本，先后有人嘗試利用原代綿羊睪丸細胞、原代綿羊腎細胞、原 代犢牛睪丸細胞生產山羊痘疫苗，但是均有一定的局限性。而且，目前國內綿羊養殖水平不 一，羔綿羊感染布氏桿菌、支原體、牛病毒性腹瀉病毒等致病菌及病毒的幾率較高，也在很 大程度上增加了操作人員生物安全風險和生產檢驗成本。因此，為了進一步降低生產成本， 提高疫苗安全性和穩定性，減少使用實驗動物，人們開始尋找可以用于培養山羊痘病毒的 傳代細胞及生產檢驗方法。
[0005] 非洲綠猴腎細胞系Vero是世界衛生組織允許用于疫苗生產的細胞株，它對多種 病毒敏感，我們經過試驗，選育出該細胞的密度抑制型非洲綠猴腎細胞系克隆株(命名為 VeroBlO)，該細胞界限清晰，整齊、胞質清晰折光性強，具有生長周期長、無致瘤性等優點， 且山羊痘病毒AV41在該細胞中能夠穩定、高效增殖，可以用于培養生產山羊痘病毒疫苗。 我們用這一傳代細胞替代羔綿羊原代細胞，建立了傳代細胞源山羊痘活疫苗的生產方法和 效力、中和抗體檢驗方法。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于提供一株用于生產山羊痘疫苗的細胞株及生產疫苗的方法克 服現有山羊痘疫苗生產技術存在的缺陷。
[0007] 本發明是通過以下技術方案實現的： 一種用于生產山羊痘疫苗的細胞株，所述細胞株為非洲綠猴腎細胞VeroBlO,其于 2014年9月24日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCCNo. 9705。
[0008] 本發明所述生產山羊痘疫苗的方法包括如下步驟： (1) 細胞傳代與培養：將非洲綠猴腎細胞VeroBlO細胞以0. 25%胰酶消化后，傳代培養， 以細胞生長液繼續培養，37°C繼續培養，細胞長成單層時接種病毒； (2) 建立毒種種子批：采用步驟（1)中已經形成良好單層的細胞培養瓶，棄去細胞生長 液，分別接種山羊痘病毒AV41株，吸附1小時后，補加維持液，37°C繼續培養，至75%以上細 胞出現病變，凍融細胞，收獲病毒液，再繼續進行傳代培養至5代，取第1-3代凍存液為毒種 種子批； (3) 制備細胞毒液：選擇步驟（1)生長良好并形成單層的非洲綠猴腎細胞VeroBlO細 胞，消化后分別以轉瓶或者生物反應器培養至細胞密度l〇6/ml，棄去細胞生長液，接種步驟 (2)所制毒種液，加入細胞維持液，繼續培養，待72~120小時內細胞病變達到75%以上時收 獲細胞毒液，置_15°C保存。
[0009] (4)配苗，凍干：當細胞毒液病毒含量蘭104 5TCID5Q/0. 1ml時，取病毒液按照1:1配 比與凍干保護劑混合均勻后定量分裝，按照程序凍干后軋蓋密封即成。
[0010]上述方法，所述細胞生長液的組成為：體積百分含量92%~94%DMEM液，6%~8%新生 牛血清，pH值為7. 0~7. 2。
[0011] 上述方法，所述細胞維持液組成為：體積百分含量98%~99%DMEM液，1%~2%新生牛 血清，pH值為7. 1~7. 4。
[0012] 本發明還包括一種非洲綠猴腎細胞VeroBlO檢驗山羊痘疫苗效力的方法，即采用 傳代細胞法代替原代細胞法和山羊效力檢驗方法，采用的技術方案是： (1) 利用VeroBlO細胞制備96孔板細胞單層； (2) 采用VeroBlO細胞單層測定山羊痘病毒疫苗的TCID5(I;步驟如下； 將細胞用胰酶消后，加入細胞生長液，細胞計數后制成細胞懸液2~3X105個/ml，接種 到96孔板，每孔加入細胞懸液100L; 在離心管中將病毒液用細胞維持液作連續10倍的稀釋，從ktlkt1% 將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養板中，每一稀釋度接種一縱排共8孔，每孔接種 100L； 設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排；（100L生長液+100L細胞懸液）； 37°C，5%C02培養，逐日觀察并記錄結果，一般需要觀察5-7天； 按Reed-Muench兩氏法計算TCID5(I; (3) 當每頭份疫苗中山羊痘病毒含量不低于104 25TCID5(I時，判定該疫苗效力合格。
[0013] 本發明還包括一種應用非洲綠猴腎細胞VeroBlO細胞檢驗羊血清中抗山羊痘病 毒抗體效價的方法，該方法包括： (1) 利用VeroBlO細胞制備96孔板細胞單層； (2) 采用VeroBlO細胞單層測定山羊痘病毒疫苗的TCID5Q濃度，其步驟與上述非洲綠 猴腎細胞VeroBlO檢驗山羊痘疫苗效力的方法中的步驟（2)相同； (3)采用細胞單層檢測中和效價，步驟如下： 將細胞用胰酶消后，加入細胞生長液，細胞計數后制成細胞懸液2~3X105個/ml，接 種到96孔板，每孔加入細胞懸液lOOiiL，置37°C，5% 0)2培養成單層細胞備用； 按照病毒液TCID5(I濃度，將山羊痘病毒用細胞維持液稀釋成200TCID5(|/100yL; 在離心管中用細胞維持液將山羊痘陽性血清作連續對比稀釋，設置8個濃度梯度，分 別為 2' 2' 2' 2' 2' 2' 2' 2-8; 將稀釋后病毒液與各個稀釋度的血清等體積混合，置37°C孵育lh; 棄去96孔培養板中細胞生長液，加入上述混合液，每一稀釋度接種6孔，每孔接種 100uL； 37°C，5%C02培養，逐日觀察并記錄結果有無細胞病變的孔數； 連續觀察5-7天后，按Reed-Muench兩氏法計算半數組織保護量P5(l和血清中和效價1〇lgP5〇。
[0014] 本發明的有益效果是：與原代細胞生產方法相比，本發明具有以下優勢： (1) 山羊痘病毒AV41株用VeroBlO細胞進行培養，病毒適應性好，返強風險低； (2) 傳代細胞疫苗在病毒產量、均一性、純粹等方面都優于原代細胞疫苗； (3) 成本低，無需使用動物； (4) 傳代細胞疫苗的安全性優于原代細胞疫苗，免疫效力不低于原代細胞疫苗。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合具體實施實例對本發明做進一步描述，這些實例僅用于例證，不限制本 發明保護范圍。若未特別指明，實施實例中所用的技術手段為本領域常用技術方法。
[0016] 實施例1 山羊痘病毒AV41株在不同細胞中的增殖能力比較 (1)毒株與細胞：山羊痘病毒雞胚弱毒株AV41 (未純化）購自中國獸藥監察所，倉鼠腎 細胞（BHK21)、豬睪丸細胞（ST)、牛胚腎細胞（MDBK)3種細胞均購自中國獸醫藥品監察所， VeroBlO本實驗室篩選保存。VeroBlO細胞克隆株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會 普通微生物中心，保藏編號：CGMCCNo. 9705。
[0017](2)細胞生長液：（體積百分含量）92%DMEM液，8%新生牛血清，pH值為7. 0;細胞 維持液：（體積百分含量）98%DMEM液，2%新生牛血清，pH值為7. 3。
[0018] (3)病毒增殖：按照常規方法傳代制備上述4種細胞單層，分別接種山羊痘病毒 AV41株，37°C培養并觀察細胞病變，當病變達到75%或培養7天后收獲細胞培養液，再次分 別接種4種細胞單層，連續傳代6代。
[0019] (4)病毒在不同細胞上的