純綠青霉菌株及用其生產麥角甾醇過氧化物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種用菌株生產化學品的技術領域，具體涉及一種用純綠青霉菌株LPPVOOI制備麥角甾醇5，8過氧化物的方法。
【背景技術】
[0002]純綠青霉菌株LPPV001來源于四川涼山產地衣植物內生真菌，經自采方式提取，菌株保藏編號:10145，保藏日期:2015年I月4日，保藏地點:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。植物留醇具有營養價值高、生物活性強的特點，是多種激素、維生素D及留族化合物合成的前體，廣泛應用在醫藥、化妝品、動物生長劑及紙張加工、印刷、紡織、食品等領域。研究發現過氧麥角留醇具有促進白血病細胞HL60細胞(Toshiyuki Takei, Mitsuru Yoshida, Mayumi Ohnish1-kameyama, et al.Ergosterolperoxide, an apoptosis—inducing component isolated from Sarcodon aspratus(Berk.) S.1to, B1sci, b1techno I b1chem, 2005, 69 (I): 212-215)和肝癌細胞0fepG2)(蘇日古格，包海鷹，圖力古爾等.蒙古口蘑子實體的抗腫瘤活性，食品科學，2012，33 (21): 280-284)凋亡的活性，同時具有抗氧化(馮建，秦淑亮，胡兵等.色釘菇子實體化學成分及其生物活性初探，菌物學報，2014，33 (2): 355-364)、抗菌(麻兵繼，文春南，吳婷婷等，麥角留醇過氧化物的抑菌活性研究，食品研究與開發，2012，33
(7): 42-44)以及抗結核(魏丹丹等，2009)等廣泛的藥理作用。麥角留醇5，8過氧化物是在真菌中較為廣泛存在的一個具有較廣泛生物活性的植物留醇類化合物。而本發明提取的該純綠青霉菌株LPPV001，可以通過發酵產生麥角留醇5，8過氧化物且產率極高，經簡單提純即可得到麥角留醇5，8過氧化物純凈物。
[0003]在對地衣內生真菌化學成分的研究過程中，課題組從四川產擬肺衣植物中分離得到一株純綠青霉菌{Penicillium verrucosum LPPVOOI,中國科學院微生物研究所命名)，經研究發現其菌絲體提取物中麥角留醇過氧化物的含量極高，最高可達到0.45g/g(麥角甾醇/菌絲體)。該菌株具有生長速度快，生長條件溫和，代謝過程簡單等優點，適于工業大規模培育，且產物產率高，適于提取。發酵培養基采用土豆培養基，成本低，制備簡單，易于操作，產量高，發酵周期短，可實現規模生產。
[0004]本發明具備較大的實踐意義，麥角甾醇5，8過氧化物是重要的有機中間體，目前尚未發現其他菌株能夠實現對此物質的發酵產率能達到如此高的水平，以及如此方便簡單的提純條件，為麥角留醇5，8過氧化物的提取開辟了一條簡單易操作的技術路線。
【發明內容】
[0005]本發明旨在提供Penicillium verrucosum LPPVOOI及其產物麥角留醇5，8過氧化物制備方法，所述麥角留醇5，8過氧化物結構如圖1。
[0006]本發明所涉及的麥角甾醇5，8過氧化物的生產菌是PeniciIlium verrucosumLPPVOOI,由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號:10145，保藏日期:2015年I月4日，保藏地點:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0007]本發明保護一種制備麥角甾醇5，8過氧化物的方法:發酵Penicilliumverrucosum LPPV001,經乙酸乙酯萃取,過娃膠柱層析，以石油醚和丙酮的混合溶劑洗脫，得到麥角留醇5，8過氧化物純品。所述發酵的條件具體可為種子液搖床2天，5%的接種量，26.7°C，轉速為150轉/分鐘，搖床15天。
[0008]一種麥角甾醇5，8過氧化物的生產用菌株，其特征在于:該菌株LPPV001為純綠青霉{Penicillium已于2015年I月4日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心并成活，保藏號為CGMCC N0.4468。
[0009]一種用菌株LPPV001生產麥角甾醇5，8過氧化物的生產方法，其特征在于:
取斜面培養3天的純綠青霉LPPV001適量；將所述適量LPPV001接種到若干瓶500mL的三角瓶中，其均裝有土豆培養基培養出的150mL培養液；將上述三角瓶裝載于26.7°C >150轉/分鐘搖床上，搖床培養5-31天，使得發酵液與菌絲體分離，分離出發酵液，連續用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并3次的萃取液，減壓濃縮得濃縮液A ;分離出菌絲體，連續以3倍量95%乙醇超聲提取3次，合并3次乙醇提取液，減壓濃縮，對超聲提取后的菌絲體，連續以2倍量的乙酸乙酯萃取三次，合并3次乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮得濃縮液B ;合并濃縮液A與B，得麥角留醇5，8過氧化物粗提物，加入100-200目過篩的硅膠拌樣，以石油醚/丙酮=48:5的混合溶劑進行300-400目硅膠柱層析，得流份fl-ΠΟ，分離流份f7，經反復控制溫度下重結晶，得化合物麥角留醇5，8過氧化物的純品。
[0010]前述生產的麥角留醇5，8過氧化物的純品的純度檢測方法，其特征在于:
1)溶解性判斷，將其用氯仿、丙酮溶解，觀察其溶解性；
2)觀測其熔點，常溫下其熔點在176-178°C之間；
3)用ES1-MS檢測，觀察其是否在m/z429.07給出[M+H]+峰；
4)通過IHNMR譜檢測，分析其是否具有環內雙鍵，以及是否具備反式直鏈烯烴結構；通過13CNMR譜檢測，分析其是否具有28個碳原子信號，以及是否有4個烯碳原子信號。
[0011]前述生產方法中利用的土豆培養基，其特征在于:土豆培養基的組成配比為:馬鈴薯:200g、瓊脂:20g、葡萄糖:20g、水=100mL0
[0012]前述的土豆培養基，其特征在于:所述的土豆培養基的組成配比為:馬鈴薯:200g、瓊脂:20g、葡萄糖:20g、水:1000mL;搖床培養時間具體為5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31 天。
[0013]本發明提供的純綠青霉verrucosum LPPV001主產兩種產物,其中一個產物麥角留醇5，8過氧化物產量高，分離工藝簡單，易于操作，該菌株穩定，培養基配方簡單，成本低，可通過大規模發酵方式實現活性物質的大量生產。
【附圖說明】
[0014]圖1為麥角甾醇5，8過氧化物的化學結構式。
[0015]圖2為麥角甾醇5，8過氧化物標準品的HPLC，濃度:50 μ g/mL。
[0016]圖3為麥角甾醇5，8過氧化物的HPLC標準曲線。
[0017]圖4麥角甾醇5，8過氧化物粗提液的HPLC分析圖，濃度:145.84 μ g/mL。
[0018]圖5為麥角甾醇5，8過氧化物的質譜圖。
[0019]圖6為麥角甾醇5，8過氧化物的核磁共振氫譜圖。
[0020]圖7為麥角甾醇5，8過氧化物的核磁共振碳譜圖。
【具體實施方式】
[0021]實施例1 LPPV001菌株的分離和鑒定
1、菌株分離
采用內生真菌分離的方法分離純綠青霉。
[0022](A)選取新鮮的擬肺衣地衣一小塊(約I X Icm)，在解剖鏡下用刀片小心除去其上下表面附著的雜質；
(B)將地衣上下表面放自來水下分別沖洗3-5分鐘，拿出待用；
(C)將地衣體放入超凈工作臺，上下表面紫外線照射分別滅菌15分鐘。將刀片在火焰上灼燒滅菌，待冷卻后，在解剖鏡下小心翼翼刮去皮層，露出髓層到可以挑取約
0.5X0.5μπι菌絲塊時，挑取一塊菌絲放在事先準備好的載有無菌水的擦鏡紙上，將包有髓層菌絲碎片的擦鏡紙放于漏斗中，用400mL無菌自來水沖洗髓層碎片，沖洗后的髓層碎片在解剖鏡觀察下，小心接種入培養基斜面培養，所述培養基組成為馬鈴薯200g、瓊脂20g、葡萄糖20g、水:1000mL。26.7°C條件下，培養箱中培養14天，觀察，將不純菌落再培養，直至得到純的菌落。
[0023]2、LPPV001菌株的鑒定
該純綠青霉菌株LPPVOOI為涼山彝族自治州西昌大涼山產擬肺衣植物的內生真菌，經多項分類學研究鑒定為Penicillium rerrwc1s??;并由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號:10145，保藏日期:2015年I月4日，保藏地點:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所。
[0024]用CTAB法提取LPPVOOI菌株的DNA，并以此DNA為模板，以ITSl和ITS4為通用引物，進行PCR擴增，純化回收擴增產物后測定其基因序列，序列如下:
I taacaaggtt tccgtaggtg aacctgcgga aggatcatta ccgagtgagg gccctctggg61 tccaacctcc cacccgtgtt tattttacct tgttgcttcg gcgggcccgc ctttactggc121 cgccgggggg ctcacgcccc cgggcccgcg cccgccgaag acaccctcga actctgtctg181 aagattgaag tctgagtgaa aatataaatt atttaaaact ttcaacaacg gatctcttgg241 ttccggcatc gatgaagaac gcagcgaaat gcgatacgta atgtgaattg caaattcagt301 gaatcatcga gtctttgaac gcacattgcg ccccctggta ttccgggggg catgcctgtc361 cgagcgtcat tgctgccctc aagcccggct tgtgtgttgg gccccgtcct ccgattccgg421 gggacgggcc cgaaaggcag cggcggcacc gcgtccggtc ctcgagcgta tggggctttg481 tcacccgctc tgtaggcccg gccggcgctt gccgatcaac ccaaattttt atccaggttg541 acctcggatc aggtagggat acccgctgaa cttaagcata tcaata將所得基因序列登錄Genbank，對比同源性，發現測試結果與verru