重組人乙型肝炎病毒核心蛋白融合蛋白的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，涉及一種融合蛋白，具體涉及一種重組人乙型肝炎 病毒核心蛋白融合蛋白。
【背景技術】
[0002] 融合蛋白是指利用基因工程技術，將兩種或兩種以上在自然狀態下互相分離的蛋 白質融合到一起，被融合的各個部分都處在同一條氨基酸鏈上，作為一個整體進行表達。融 合蛋白在生命科學相關研究領域及生物產業均有廣泛用途。
[0003] 將兩種蛋白質融合表達，通常的方法是將編碼這兩種蛋白的DNA序列按順序連接 在一起，形成一個融合的DNA分子，將該DNA分子轉入細胞后，在真核啟動子的驅動下，即可 轉錄出相應的mRNA，繼而以這些mRNA為模板，利用細胞的翻譯機器產生融合蛋白。
[0004] 構建融合蛋白時，非常重要的一個問題是要保持被融合各部分的功能。如果兩種 蛋白僅僅是在一級序列（氨基酸）水平的物理融合，而融合后的蛋白不能還原被融合的兩 部分的功能，那么這種融合蛋白的價值將非常有限。為了保持被融合部分的各自功能，首 先需要保持融合部分的各自正常結構，因為結構是功能的基礎。為了使兩部分各自形成正 確結構，可以采用一些方式將這兩部分進行適當分隔，以盡量減少兩部分間的相互干擾，通 常，這些方式是利用一些氨基酸接頭置于要融合的兩部分之間，以達到分隔效果。作為接頭 的氨基酸一般是柔性和不帶電荷的親水性氨基酸，常用的是甘氨酸（Gly)和絲氨酸（Ser)， 由這兩種氨基酸按一定順序排列，并重復不同次數，即可形成各種接頭，這些接頭的長度通 常從6-45個氨基酸不等。然而，采用這些形式和長度的接頭在某些情況下并不能達到保持 融合蛋白各部分功能的目的。
[0005] 乙型肝炎（乙肝）病毒核心蛋白（Hepatitis B virus core protein，HBc)是乙 肝病毒的一種結構蛋白，它是病毒核心顆粒的基本組成單位，一個病毒核心顆粒通常由240 個核心蛋白組成。核心顆粒是乙肝病毒復制的場所，在無核心顆粒或者核心顆粒不完整時， 病毒DNA的復制將無法進行，因此，HBc也是乙肝病毒復制所必需的，判斷HBc的功能是否 正常，最重要的是看其表達能否支持病毒DNA的復制。
[0006] 綠色熒光蛋白（GFP)和紅色熒光蛋白（RFP)是常用的標記蛋白，因能在被特定波 長的激發光激發時分別發出綠色和紅色熒光，故常用來與其他蛋白質融合，以方便觀測其 他蛋白質的生物學行為。GFP或RFP的功能是否正常，主要在于其是否能在被激發時發出綠 色或紅色突光。
[0007] Weigand等人（J Gen Virol, 2009)曾將GFP融合到HBc上，結果發現該融合蛋白 能保持GFP的正常功能（發綠色熒光），但不能保持HBc的正常功能，即不能形成核心顆粒。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種重組人乙型肝炎病毒核心蛋白 融合蛋白。
[0009] 本發明的第一方面提供了一種重組人乙型肝炎病毒核心蛋白融合蛋白，所述融合 蛋白從N端到C端依次含有蛋白（X)、接頭肽（L)和乙肝病毒核心蛋白（HBc)，所述接頭肽 (L)的氨基酸序列為：
[0010] Gly-Ser-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，式中所述n 是 2 ~20 的整數，所述接頭肽（L) 的C端連接于HBc的N端，所述蛋白⑴的C端連接于接頭肽的N端。
[0011] 在另一優選例中，所述接頭肽（L)的氨基酸序列為 Gly-Ser-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中 n 等于 9 或 18。
[0012] 在另一優選例中，所述蛋白（X)為紅色熒光蛋白或水泡口炎病毒G糖蛋白。
[0013] 在另一優選例中，當蛋白（X)為紅色熒光蛋白時，n等于9或18 ;當蛋白（X)為水 泡口炎病毒G糖蛋白時，n等于18。
[0014] 在另一優選例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No: 1、2或3所示。
[0015] 本發明的第二方面提供了一種分離的核酸序列，所述核酸序列為本發明第一方面 所述接頭肽（U的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID No:4或5所示。
[0016] 本發明的第三方面提供了一種編碼本發明第一方面所述所述融合蛋白的核酸序 列，所述核酸序列含有本發明第二方面所述的接頭肽（L)的核酸序列。
[0017] 本發明的第四方面提供了 一種表達載體，所述表達載體含有本發明第三方面所述 的核酸序列。
[0018] 本發明的第五方面提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞被本發明第四方面所述的 表達載體轉染。
[0019] 本發明融合蛋白可通過將紅色熒光蛋白基因或水泡口炎病毒G糖蛋白、HBc基因 以及連接二者的接頭肽核酸通過基因重組、轉染宿主細胞表達獲得。
[0020] 本發明的有益效果是：本發明通過構建含有4X甘氨酸-IX絲氨酸（G4S)的多個 氨基酸的長接頭，將融合位點設置在HBc的N端，連接HBc與功能蛋白，能達到同時保持接 頭兩端蛋白的功能的目的，解決了目前還沒有功能蛋白與HBc融合后還能同時保持兩種蛋 白的功能的難題，對于HBV的研究有重要意義。本發明構建的融合蛋白可應用于病毒顆粒 示蹤、可作為疫苗載體等。本發明設計的多氨基酸連接肽還可以應用在其它功能蛋白與HBc 的融合上，用于構建藥物篩選模型等方面，應用前景廣闊。
【附圖說明】
[0021] 圖1是質粒pCH9/3091、HBVl. lc-及HBc的結構示意圖。
[0022] 圖2是HBV1. lc-及HBc的功能鑒定Southern blot檢測結果圖。
[0023] 圖3是不同長度G4S接頭對HBc功能影響的Southern blot檢測。
[0024] 圖4是不同長度G4S接頭GFP-HBc中綠色熒光蛋白表達檢測圖。
[0025] 圖5是不同長度G4S接頭GFP-HBc的Western blot蛋白檢測結果圖。
[0026] 圖6是核心顆粒顆粒檢測結果圖；其中，1 :GFP-47G4S-HBc+HBVl. lc-，2 : GFP-92G4S-HBc+HBVl. lc-，3 :GFP-186G4S-HBc+HBVl. lc-。
[0027] 圖7是HBV復制中間體Southern blot檢測結果圖。
[0028] 圖8是三種融合RFP-HBc中紅色熒光蛋白檢測結果圖。
[0029] 圖9是三種融合RFP-HBc中HBV復制中間體Southern blot檢測結果圖。
[0030] 圖 10 是 VSVG-92G4S-HBc 及 VSVG-186G4S-HBc 中 HBV 復制中間體 Southern blot 檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0031] 本發明實施例中所用試劑來源如下：
[0032] 質粒pCH9/3091 :德國弗萊堡大學Michael Nassal贈送
[0033]質粒 pEGFP-Nl :Clonetech 公司，美國
[0034] PrimeSTAR HS 高保真聚合酶、5XPrimeSTAR HS buffer、dNTP、2XPrimeSTAR
[0035] HS premix :Takara 公司，日本
[0036] 膠回收試劑盒：QIAGEN公司，德國
[0037] DpnI、大腸桿菌JM109感受態細胞：Promega公司，美國
[0038] HEK293細胞：美國模式菌種收集中心（ATCC)
[0039] 抗HBc多克隆抗體：DAK0公司，丹麥
[0040] 抗GFP多克隆抗體：0rigene公司，美國
[0041] PCR產物純化試劑盒：Roche公司，德國
[0042] BsmB I、Tango buffer、DTT :Thermo scientific 公司，美國
[0043] T71igase :Enzymatics 公司，美國
[0044] ATP :New England Biolabs 公司，美國
[0045] 實施例一、HBV1. lc-及HBc表達載體構建
[0046] HBV DNA的成功復制需要核心蛋白基因、HBV聚合酶（Pol)基因以及前基因組 RNA(pgRNA)共同作用。
[0047] 首先構建含HBV核心蛋白基因的HBc質粒，以作為HBc改造的基礎。構建的HBc 質粒僅表達HBV中由Core基因編碼的HBc蛋白，不表達Pol基因和pgRNA。
[0048] 為了檢測改造后HBc的功能，還需構建HBc表達缺失的質粒HBV1. lc-。質粒 HBV1. lc-不能表達HBV核心蛋白基因，但可表達HBV聚合酶（Pol)基因以及前基因組 RNA(pgRNA) ;HBc可反式提供HBV核心蛋白，支持HBVDNA復制。當有功能正常的HBc與 HBV1. lc-同時存在時，即可恢復HBV DNA復制。
[0049] 構建HBc的方法是在含1. 1倍體HBV基因組的質粒pCH9/3091基礎上，將HBV中 的Core基因下游的HBV DNA大部分序列去除，保留HBV polyA終止信號及前端240bp序列。 構建的HBc質粒由外源啟動子pCMV啟動轉錄，HBV自身的polyA信號終止轉錄。
[0050] HBV1. lc-的構建方法是在pCH9/3091基礎上，將HBV中的Core基因的第40個氨 基酸序列突變成終止密碼序列，從而不表達HBc蛋白，但同時不干擾HBV其他基因的表達。 HBV1. lc-及HBc的結構如圖1所示。
[0051] 具體構建方法如下：
[0052]一、HBV1.lc-質粒構建
[0053] (1)以質粒PCH9/3091為模板，設計突變引物，使其HBc第40位氨基酸突變為終止 密碼，設計的突變引物上游引物Fcm序列為：
[0054] 5'-GATACCGCCTCAGCTCTGTATCGGTAAGCCTTAGAGTCTCCTGAGCATTG-3' ，下游引物 R2350 為：5' -CTCGTCGTCTAACAACAGTAGTCT-3'，用 PrimeSTAR HS 高保真聚合酶作 PCR 擴 增，反應體系：30ng pCH9/3091 模板，引物 Fcm(lOiiM)及 R2350(10iiM)各 liil，0. 5ul PrimeSTAR HS 聚合酶，5XPrimeSTAR HS buffer 10iil，dNTP(10mM)4iil，滅菌超純水補齊 體積至5〇111。反應條件：951：預變性3111111，951：158,551：158,721：1111111，35個循環。用 膠回收試劑盒回收擴增片段。
[0055] (2)將步驟1中得到的回收片段作為大引物，用來替換模板質粒pCH9/3091中相 應片段。反應體系：300ng回收片段，50ng pCH9/3091模板，0. 5ul PrimeSTAR HS高保真 聚合酶，5XPrimeSTAR HS buffer 10ii 1，濃度10mM的dNTP 1，滅菌超純水補齊體積至 50iil。反應條件：95°C 預變性 2min，95°C 15s，55°C 158,72°0 31^11，18個循環。擴增產物 中含有帶缺口的HBV1. lc-質粒，轉化細菌后能被修復成完整的HBV1. lc-質粒。擴增產物 用PCR產物純化試劑盒純化，取13ul純化產物用Dpn I 37°C消化5h，取消化后產物2ul電