金黃色葡萄球菌腸毒素b的b細胞免疫優勢表位肽及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物制藥領域，特別是涉及來自金黃色葡萄球菌腸毒素B的三個B細 胞免疫優勢表位、鑒定此B細胞免疫優勢表位的方法以及其在醫藥生物技術領域的應用。
【背景技術】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus)，作為革蘭氏陽性菌的代 表，是一類在自然界廣泛存在的致病性球菌，也是引起醫院感染和社區感染的一種重要致 病菌。調查研宄表明，在美國，社區皮膚及軟組織感染最常見的病原菌為S. aureus(約占 75% );在日本，膿皰病中S. aureus引發的大皰性膿包病占的92% ;在非洲，熱帶膿性肌炎 病原體中S. aureus占55%~72%;在中國，感染性心內膜炎的頭號致病菌為S. aureus (占 31%~34% )。此外，S. aureus感染以急性、化膿性為特征，局部可引起皮膚和軟組織等的 化膿性感染，經久不愈；全身可導致骨髓炎、膿毒性關節炎、心內膜炎、肺炎、膿毒血癥等嚴 重感染及并發癥，死亡率高達20%。同時，金葡菌的外毒素還可引起食物中毒、燙傷樣皮膚 綜合征和中毒性休克綜合征等全身致死性感染。
[0003] 金黃色葡萄球菌營養要求不高，在普通培養基上生長良好，在含有血液和葡萄糖 的培養基中生長更佳，需氧或兼性厭氧。28°c~38°C均能生長，最適溫度為37°C，pH為 4. 8~9. 4,最適為7. 4。耐鹽性強，在含10%~15%氯化鈉培養基中均能生長。在血脂平 板上形成的菌落較大，菌落周圍形成明顯的全透明溶血環（0 _溶血），溶血性菌株具有較 強致病性。按照噬菌體分型，金黃色葡萄球菌可分為5群26個型。噬菌體分型在流行病學 調查時追蹤傳染源及研宄菌型與疾病種類間的關系上均有重要意義。腸毒素型食物中毒由 III和IV群金黃色葡萄球菌引起，II群菌對抗生素產生耐藥性的速度比I和IV群緩慢很多。 造成醫院感染嚴重流行的是I群中的52、52A、80和81型菌株。引起皰瘆性和剝脫性皮炎 的菌株經常是II群71型。
[0004] 金黃色葡萄球菌耐熱性腸毒素（Staphylococcal enterotoxin，SE)，是引起人類 食物中毒、全身炎癥反應和膿毒癥休克的主要原因，也是金黃色葡萄球菌疫苗研宄最重要 的保護性抗原之一。SE因血清型差異SE分為SEA、SEB及SEC等多種型，每株臨床MRSA分 離株可分泌1 _2種腸毒素，其中SEB，SEC及TSST-1最豐富。每株金黃色葡萄球菌能產生一 型或兩型以上的腸毒素。近年發現，造成醫院感染的耐甲氧西林金葡菌，80%以上產生腸毒 素 B(Staphylococcal enterotoxin B，SEB)。個別醫院分離株幾乎 100%產 SEB。
[0005] 金葡菌SEB屬于超抗原，不需要抗原呈遞細胞的加工處理，以完整的蛋白質分子 直接與在MHC II類分子的a #吉構域和TCR的0鏈V區結合，從而刺激T細胞活化增殖， 釋放大量細胞因子如IL-2、IFN-Y及TNF-a。由金葡菌SEB引起的中毒性休克綜合征的 病死率可達50 %，而與流感并發的金葡菌SEB感染其死亡率可達90 %以上，因此，氣溶膠中 的金葡菌SEB是一種潛在的生化武器。當SEB進入機體后，其超抗原的結合引起單個核細 胞活化，導致廣泛的細胞因子釋放，而早期的TCR- a 0 T細胞釋放的TNF- a對死亡的發生 起了重要的作用。
[0006] 經Blast比對證實，SEB在MRSA各菌株中序列保守，結構穩定。在小鼠模型中的研 宄證實，SEB具有比其他抗原更好的體液應答優勢，合成的人SEB單克隆抗體可預防MRSA感 染常見的毒性休克綜合癥。但SEB本身為毒素，用于人體存在安全隱患，因此，失去毒性的 突變體SEB是MRSA疫苗較好的保護性抗原。目前，SEB突變體疫苗用于SEB中毒及抗MRSA 感染已在動物模型中獲得成功。
[0007] 蛋白抗原發揮其功能主要通過表位來體現特異性。用SEB表位中的優勢表位來制 備疫苗，有利于去除不利成份，增強免疫效果。因此，SEB抗原中免疫優勢應答的保護性表 位的鑒定，是提升和優化基于SEB抗原的S. aureus疫苗設計的重要前提。篩選SEB的多個 免疫優勢表位，將各抗原的表位進行串聯所得到多表位多肽疫苗可以激發更有效的免疫應 答。目前的已知的SEB的B細胞表位有5個，所用的篩選方法主要是生物信息學預測和單 克隆抗體篩選。用生物信息學預測抗原的B細胞表位準確率不高，預測出的表位僅局限于 特定長度的肽段，無法預測免疫優勢表位。研宄也證實，實驗所得的B細胞表位與生物信息 學軟件預測的結果并不一致。用單克隆抗體篩選抗原的B細胞表位步驟繁瑣，試驗周期長， 所鑒定的抗原B細胞表位的不全，也無法鑒定免疫優勢表位。因此，建立一種準確有效的篩 選及鑒定B細胞免疫優勢表位的方法顯得尤為重要。
【發明內容】
[0008] 本發明提供一種金黃色葡萄球菌腸毒素B的B細胞免疫優勢表位肽，其氨基酸序 列如SEQ ID NO:42所示。其對應的核心表位的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:69所示。
[0009] 本發明提供一種鑒定所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B的B細胞免疫優勢表位肽的 方法，其主要包含步驟：
[0010] 1)用金黃色葡萄球菌腸毒素B的突變體免疫小鼠獲得抗血清；
[0011] 2)步移合成覆蓋金黃色葡萄球菌腸毒素B全長序列的重疊18肽；
[0012] 3)用步驟1)所得的抗血清結合步驟2)所得的重疊18肽篩選金黃色葡萄球菌腸 毒素B的B細胞免疫優勢表位肽；
[0013] 4)用步驟3)所篩得的B細胞免疫優勢表位肽與鑰孔血藍蛋白偶聯，所得偶聯物用 于動物免疫，獲得免疫優勢肽抗血清；所述免疫優勢表位抗血清進行金黃色葡萄球菌腸毒 素B的中和能力檢測，鑒定所述B細胞免疫優勢表位肽為目標B細胞免疫優勢表位肽。
[0014] 進一步地，上述鑒定方法包含步驟：
[0015] 5)針對步驟3)所得的B細胞免疫優勢表位肽序列，從N-端及C-端分別依次截斷 2個氨基酸，合成各B細胞免疫優勢表位肽所對應的截斷肽；
[0016] 6)用步驟4)獲得的所述免疫優勢肽抗血清結合步驟5)所述的截斷肽，來確定所 述B細胞免疫優勢表位肽的最小表位；
[0017] 7)用步驟6)所篩得的B細胞免疫優勢表位肽的最小表位與鑰孔血藍蛋白蛋白偶 聯，所得偶聯物用于動物免疫，獲得免疫優勢表位抗血清；
[0018] 8)用步驟7)獲得的所述免疫優勢表位抗血清進行金黃色葡萄球菌腸毒素B的中 和能力檢測；
[0019] 9)用生物信息學方法確定步驟6)所確定的B細胞免疫優勢表位肽的最小表位在 金黃色葡萄球菌各個菌株中的保守性，并明確其在金黃色葡萄球菌腸毒素B蛋白三維結構 中的位置。
[0020] 所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B的B細胞免疫優勢表位肽具有高免疫原性，可引 發強烈的免疫反應；用所述免疫優勢表位免疫動物所獲的抗血清均具有特異性中和SEB毒 素的作用。所述免疫優勢表位不含有不必要甚至有害的部分，從而降低由其所制備的疫苗 的使用風險，具有較大的疫苗應用價值，可用于制備金黃色葡萄球菌腸毒素B表位疫苗和/ 或預防疫苗。
[0021] 本發明通過用SEB突變體（rSEB)免疫BALB/c小鼠獲得預防S. aureus (金黃色葡 萄球菌）感染的抗血清，結合覆蓋SEB全長的42條重疊肽逐步篩選出了 SEB的B細胞三個 免疫優勢表位肽。用免疫優勢表位肽一KLH(鑰孔血藍蛋白）偶聯物免疫動物，獲得的了可 強烈結合SEB毒素的表位肽特異性抗血清。接著用分別覆蓋三個免疫優勢表位肽的多個截 斷重疊肽與該表位肽抗血清進行進一步篩選，明確了該免疫優勢表位肽的核心序列即優勢 表位。在體外，鑒定的三個免疫優勢表位均可中和天然SEB毒素的超抗原能力。本發明所 提供的篩選和鑒定方法準確率高，可以避免漏篩和誤篩現象，可以區別抗原表位的免疫顯 性和免疫亞顯性，并且所篩選出的抗原表位均能在動物體內誘發高水平優勢表位抗血清， 并且該抗血清具有中和SEB毒素超抗原能力的功能，由此使得制備高效、低毒、高安全性的 基于SEB的疫苗成為可能。
[0022] 本發明用覆蓋抗原蛋白全長的多組重疊肽結合ELISA法篩選金黃色葡萄球菌腸 毒素B的免疫優勢B細胞表位肽，進一步用覆蓋優勢表位肽全長的截斷重疊肽結合ELISA 法來明確該優勢表位肽的核心序列，方法簡便快速，表位無遺漏，獲得了金黃色葡萄球菌腸 毒素B的B細胞的三個免疫優勢表位。該免疫優勢表位均具有較強的免疫原性，用該優勢 表位免疫動物，免疫制劑無無關成分或有害成分，可獲得高水平的優勢表位抗血清，并且， 該抗血清可強烈中和SEB毒素的超抗原能力。以該優勢表位為活性成分的疫苗比SEB全 蛋白突變體疫苗具有更好的預防和中和誘發的SEB毒素的作用，由于優勢表位SEB 97_112及 SEB2(I7_222在多種S. aureus菌株中序列保守，提示其對其他S. aureus感染也具有良好的應 用前景。
[0023] 為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。
【附圖說明】
[0024] 圖1為金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫優勢表位肽的篩選。
[0025] 圖2為金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫優勢表位肽抗血清與天然SEB的結合檢 測。
[0026] 圖3Ai至圖3Cii為金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫優勢表位的最小表位確定；其 中
[0027] 圖3Ai為SEB97_112的最小表位確定；
[0028] 圖3Bi為SEB2Q7_222的最小表位確定；
[0029] 圖3Ci為SEB247_257的最小表位確定；
[0030] 圖3Aii，圖3Bii及圖3Cii分別是亞優勢表位肽 SEB31-48, SEB133-15。及 SEB 193_210的 核心序列。
[0031]圖4A至圖4D為金黃色葡萄球菌腸毒素B的免疫優勢最小表位抗血清對該毒素的 中和能力的檢測；其中
[0032]圖4A為免疫優勢最小表位抗血清中和了金黃色葡萄球菌腸毒素B誘導的T細胞 增殖；
[0033] 圖4B為免疫優