用于鑒定能夠誘導呼吸道致敏的物質的方法和用于該方法中的陣列和分析試劑盒的制作方法
【專利說明】用于鑒定能夠誘導呼吸道致敏的物質的方法和用于該方法 中的陣列和分析試劑盒 發明領域
[0001] 本發明涉及用于鑒定能夠誘導呼吸道致敏（respiratory sensitization)的物質 (agent)的方法以及用于所述方法中的陣列和分析試劑盒。
【背景技術】
[0002] 通常，將過敏定義為在對其他方面無害的抗原產生免疫應答后呈現的不良狀態。 它是稱為超敏反應的一類結果中的成員，將超敏反應定義為導致組織損傷的有害免疫應答 (Janeway, C. , Travers, P. , Hunt, S. , ffalport, M. , 1997. Allergy and hypersensitivity. ImmunoBiology:The Immune System in Health and Disease. Garland Publishing, New York)。所導致的工業毒理學家特別關注的病癥包括呼吸道過敏和過敏性接觸性皮炎 (A⑶）。呼吸道過敏是上和/或下呼吸道對異生物體（xenobiotic)的超敏反應。這種超敏 反應是即時的，具有在異生物體暴露后數分鐘至數小時內產生的臨床特征，并且可以包括 喘息、氣促、胸悶、支氣管收縮和/或鼻充血。在極端情況中，反應可以引發低血壓和致命的 過敏反應。在一般的人群中，呼吸道過敏最常見是由環境蛋白質誘導的，所述環境蛋白質包 括花粉、塵螨排泄物和動物毛肩。然而，在職業環境中，呼吸道過敏可以由工業化合物引起， 所述工業化合物包括高分子量（HMW)化合物，如蛋白質去污劑，以及低分子量（LMW)化學 品。由于它們的小尺寸，LMW化學變應原作為半抗原，其首先與蛋白質反應，形成復合物，然 后其能夠啟動免疫應答。
[0003] 呼吸道對HMW和LMW化合物的過敏的發展可以歸因于職業性哮喘的產生，職業 性哮喘的特征在于由于歸因于特定工作環境的誘因和條件引起的可變氣流限制和/或非 特異性的支氣管超反應性（Chan-Yeung，M.，Malo，J.L.，1994. Aetiological agents in occupational asthma.Eur. Respir. J. 7, 346-371 ；Karol,M. H. , 1994. Animal models of occupational asthma. Eur. Respir. J. 7, 555-568)。重要的是注意到除了這種免疫病因學 之外，非免疫原性物質，如刺激物，也在職業性哮喘的發展中起著重要作用。在許多情況中， 共同暴露于變應原和刺激物引起了病癥。臨床研宄已經表明了高達20%的成人發作哮喘 是由職業因素引起的，并且這些病例中的90%涉及免疫學機理（Mapp，C. E.，2005. Genetics and the occupational environment. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 5, 113 - 118)〇此 外，職業性哮喘是發達國家中最普遍的職業性肺病。因此，具有作為呼吸道變應原的潛能的 化合物的鑒定和表征對于工業毒理學家而言是一個重要的研宄領域。
[0004] 不是所有引起特定免疫應答的化合物都將具有引起呼吸道超敏性的潛能。較 大數量的化合物與皮膚超敏性和ACD的發展相關，并且認為對呼吸道不具有致敏作用 (Kimber,I. , Dearman, R. J. , 2005. What makes a chemical a respiratory sensitizer ? Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 5, 119-124)。與呼吸道過敏不同，ACD 是由細胞介導 的免疫應答引起的延遲型超敏反應的實例（Janeway等，1997,上文）。A⑶是最常見的職 業病之一，其中多種化合物成為病原體，因此，這些化合物的主動鑒定和表征也是相當重要 的（Saary, J.，Qureshi, R.，Palda, V.，DeKoven, J.，Pratt, M.，Skotnicki-Grant, S.，Holnes s,L. , 2005. A systematic review of contact dermatitis treatment and prevention. J. Am. Acad. Dermatol. 53, 845) 〇
[0005] 導致呼吸道過敏或ACD的超敏性的發展由兩個截然不同的階段組 成。第一個是致敏，其涉及免疫狀況的發展，而第二個是激發，其導致過敏的臨 床呈現(Briatico-Vangosa, G. , Braun, C. L. , Cookman, G. , Hofmann, T. , Kimber, I. , Loveless, S. E. , Morrow, T. , Pauluhn, J. , Sorensen, T. , Niessen, H. J. , 1994. Respiratory allergy:hazard identification and risk assessment. Fundam.Appl. Toxicol. 23, 145 - 158)。因此，之前未暴露的（未免疫（naive))但易感個體沒有經歷他 們第一次暴露于過敏性蛋白質或化學品時的過敏癥狀。最少，需要兩次暴露；然而，在許 多情況中，可能需要在數周或數月內的重復暴露。在易感個體初次遭遇過敏性化合物的過 程中，化合物被樹突細胞（抗原加工和呈遞細胞）識別為外來物，呈遞給T細胞，并且引起 特定的原發性免疫應答，這導致致敏。這接著可能是致敏的個體隨后暴露于相同化合物時 過敏的實際激發。激發通過免疫應答的激活和所得到的細胞信號來介導，所述細胞信號 導致炎性反應和過敏癥狀。過敏反應的性質和嚴重程度取決于各種因素，包括個體的遺 傳背景、變應原的特征以及致敏和激發階段過程中暴露的途徑、持續時間和強度（Arts，J. H. , Kuper, C. , 2003. Approaches to induce and elicit respiratory allergy:impact of route and intensity of exposure. Toxicol.Lett. 140 - 141, 213 - 222 ；Arts, J. H. ,Mommers, C. , de Heer, C. , 2006. Dose - response relationships and threshold levels in skin and respiratory allergy. Crit. Rev. Toxicol. 36, 219 - 251)〇
[0006] 盡管存在一些一般性的相似性，但在目前了解的呼吸道過敏和A⑶的病因學中存 在重要的機理差異。通常，將呼吸道過敏歸類為涉及IgE的I型超敏反應，而A⑶是由T細 胞介導的IV型超敏反應（Janeway等，1997,上文）。認為這些超敏性是根據特定的機理發展 的，所述機理取決于T輔助（Th)細胞的功能性亞群（即，Thl和Th2細胞）的不同激活。呼吸 道致敏和過敏的發展與T淋巴細胞的Th2群的優先誘導相關。Th2細胞的特征在于大量白細 胞介素（IL) _4、-10和-13的產生。這些細胞因子的產生有利于體液免疫功能以及B細胞的 刺激和分化，以產生 IgE(綜述于 Dearman, R. J.，Betts, C. J.，Humphreys, N.，Flanagan, B. F. ,Gilmour, N. J. , Basketter, D. A. , Kimber, I. , 2003. Chemical allergy:considerations for the practical application of cytokine profiling. Toxicol. Sci. 71, 137 - 145) 〇 這些抗體結合肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面上的受體。在隨后暴露于變應原時，這些 細胞釋放各種炎性介質，包括組胺、白細胞三烯和細胞因子，這導致了呼吸道過敏的即 時超敏性。除了促進IgE產生，Th2細胞因子還促進呼吸道過敏中涉及的其他細胞的 生長和分化，包括肥大細胞和嗜曙紅細胞（綜述于Kimber, I.，1996. Chemical-induced hypersensitivity.見:Smialowicz, R. J. , Holsapple, M. P. (Eds. ), Experimental Immunotoxicology. CRC Press, New York, pp. 391 - 417)。在重復暴露于過敏性化合物和呼 吸道過敏激發時，可能發展大范圍的氣道重塑、粘液積聚和慢性炎性應答，這引起了哮喘癥 狀的發展。
[0007] 相反，接觸性致敏和A⑶的發展主要與T淋巴細胞的Thl群的誘導相關。這些細胞 的特征在于IL-2、干擾素-y(IFN-y)和腫瘤壞死因子(TNF-0)的產生。研宄者已經 表明延遲型接觸性超敏性的發展特異地依賴于Thl細胞和IFN-0的產生（Diamantstein， T., Eckert, R. , Volk, H. D. , Kupier-ffeglinski, J. ff., 1988. Reversal by interferon-gamma of inhibition of delayed-type hypersensitivity induction by anti_CD4or anti-interleukin 2receptor (CD25)monoclonal antibodies. Evidence for the physiological role of the CD4+THl+subset in mice. Eur. J. Immunol. 18, 2101-2103)〇 致敏應答與記憶T細胞的產生相關，在隨后遭遇抗原時激活了記憶T細胞，導致了超敏性 應答。這種反應涉及角質化細胞的激活和促炎細胞因子的釋放，以募集非抗原特異性T細 胞和單核細胞至接觸部位，這導致急性炎性應答。有趣的是，Thl細胞產生的IFN-y也對 抗Th2細胞應答和IgE的產生，而Th2細胞產生的IL-4對抗Thl細胞的發展。此外，已經 發現了 IFN-y在呼吸道過敏中抑制肥大細胞功能，而IL-4抑制A⑶的激發階段（綜述于 Kimber，1996上文）。因此，不僅每種Th細胞類型的細胞因子促進它們譜系的生長和分化 以及隨后的超敏性應答，它們還對抗其他細胞群的增殖，作為進一步指引免疫應答的方式。
[0008] 從危險評價和調控觀點看，以上呼吸道過敏和A⑶之間的區別是相當重要的。研 宄者已經探宄了多種動物模型和實驗方法來鑒定具有引起呼吸道過敏潛能的化合物，然 而，沒有一種方法被研宄團體或管理機構廣泛應用或完全接受（Arts等，2006上文）。相反， 存在多種指導測定，用于檢測具有引起接觸性致敏和ACD潛能的化合物。鑒于呼吸道過敏 和ACD中致敏應答的一般性相似性，已經表明用于鑒定接觸性致敏潛能的模型也可以用于 呼吸道過敏潛能的評價。然而，由于已知的機理差異以及歸類為呼吸道變應原更嚴重的健 康和調控問題，這些化合物的精確鑒定及其與誘導ACD的化合物的區別是至關重要的。需 要的是一致的、系統的和公認的用于評價蛋白質和化合物的呼吸道過敏潛能的方法。
[0009] 呼吸道過敏是上呼吸道和下呼吸道對異生物體蛋白質或化學品的I型超敏反 應，其中臨床癥狀通常包括喘息、氣促、支氣管收縮和哮喘攻擊（Boverhof DR，Billington R,Gollapudi BB,Hotchkiss JA, Krieger SM 等(2008)Respiratory sensitization and allergy:current research approaches and needs.Toxicol Appl Pharmacol 226:1-13)。機械地，呼吸道過敏與Th2細胞的誘導和提高的B細胞的IgE產生相關。由 效應器粒細胞（如，肥大細胞和嗜堿性粒細胞）上IgE/變應原復合物引起的Fc e R:s的 交聯導致促炎分子的釋放（Boverhof 等，2008，上文；Banks DE，Tarlo SM(2000) Important issues inoccupational asthma. Curr Op in Pulm Med 6:37-42 ;Sastre J, Vandenplas 0,Park HS(2003)Pathogenesis of occupational asthma. Eur Respir J 22:364-373)〇 通常，I型超敏反應通過蛋白質變應原來引發，而低分子量化合物具有誘導過敏性接觸 性皮炎（A⑶）的傾向，A⑶是主要與Thl和⑶8+效應器細胞的誘導相關的IV型超敏 反應。然而，各種化學品，如二異氰酸醋（Zammit-Tabona M，Sherkin M，Kijek K，Chan H, Chan-Yeung M(1983)Asthma caused by diphenylmethane diisocyanate in foundry workers. Clinical, bronchial provocation, and immunologic studies. Am Rev Respir Dis 128:226-230)、酸酐（Bernstein DI, Patterson R，Zeiss CR(1982)Clinical and immunologic evaluation of trimellitic anhydride-and phthalic anhydride-exposed workers using a questionnaire with comparative analysis of enzyme-linked immunosorbent and radioimmunoassay studies. J Allergy Clin Immunol 69:311-318)、 鉬鹽（Murdoch RD，Pepys J, Hughes EG (1986) IgE antibody responses to platinum group metals:a large scale refinery survey. Br J Ind Med 43:37-43)、反應性染料（Docker A, Wattie JM，Topping MD, Luczynska CM, Newman Taylor AJ，等(1987)Clinical and immunological investigations of respiratory disease in workers using reactive dyes. Br J Ind Med 44:534-541)和氯胺T(Bourne MS，Flindt ML，Walker JM(1979)Asthma due to industrial use of chloramine. Br Med J 2:10-12)可能誘導呼吸道致敏，結果產 生職業性哮喘和鼻炎。與引起接觸性皮炎的那些相比，已知較少數的化學品引起呼吸道過 敏，然而，健康影響仍然是很糟糕的，因為其可以與致命的結果相關。盡管臨床特征與對蛋 白質的過敏反應的那些相似，但應答的性質常常仍然是未知的。
[0010] REACH(化學品的注冊、評估和授權（Registration，Evaluation，and Authorisation of Chemicals))法規要求歐盟內所有新的和現有的化學品（涉及大約 30000 種化學品）應當測試有害影響（Johansson H，Lindstedt M，Albrekt AS，Borrebaeck CA:A genomic biomarker signature can predict skin sensitizers using a cell-based in vitro alternative to animal tests. BMC Genomics 2011，12:399)〇 因 為潛在的致敏劑的鑒定目前需要動物測試，REACH立法將對測試需要的動物數量具有巨大 影響。此外，2009年生效的化妝品法第7次修正案對于人使用的大部分化妝品成分的動物 測試提出了禁止，除了一些在2013年的測試之外。因此，可靠的用于評價化學品致敏能力 的實驗動物的體外替代方法的研發是迫切的。
[0011] 用于誘導呼吸道致敏的化學品的風險評價的方法的發展是非常不充分的，迄 今為止沒有可用的得到驗證的試驗（Verstraelen S，Bloemen K，Nelissen I，Witters H，Schoeters G 等（2008)Cell types involved in allergic asthma and their use in in vitro models to assess respiratory sensitization. Toxicol In Vitro 22:1419-1431) ^為了這一目的設計的主要體內測定是小鼠IgE測試（Dearman RJ，Basketter DA，Kimber I (1992)Variable effects of chemical allergens on serum IgE concentration in mice. Preliminary evaluation of a novel approach to the identification of respiratory sensitizers. J Appl Toxicol 12:317-323 ;Dearman RJ，Skinner RA, Humphreys NE，Kimber I(2003)Methods for the identification of chemical respiratory allergens in rodents:comparisons of cytokine profiling with induced changes in serum IgE. J Appl Toxicol 23:199-207) 〇 盡管顯亦出 具有前景的初期結果，實驗室間的再現性不足以正式地驗證該測定，并且目前沒有常 規地使用。然而，進行了嘗試來研發基于細胞的用于呼吸道致敏的測定，使用樹突細 胞系，如 THP-1(Verstraelen S，Nelissen I，Hooyberghs J，Witters H，Schoeters G 等（2009)Gene profiles of THP-lmacrophages after in vitro exposure to respiratory(non-)sensitizing chemicals:identification of discriminating genetic markers and pathway analysis. Toxicol In Vitro 23:1151-1162.)以及上皮 細胞系，如 BEAS_2B(Verstraelen S，Nelissen I，Hooyberghs J，Witters H，Schoeters G 等（2009)Gene profiles of a human bronchial epithelial cell line after in vitro exposure to respiratory (non-)sensitizing chemic