綠膿桿菌pcr檢測試劑盒及檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及微生物檢測技術領域，尤其是涉及一種綠膿桿菌PCR檢測試劑盒及檢 測方法。
【背景技術】
[0002] 綠膿桿菌（p. aeruginosa)或稱銅綠色假單胞菌，是一種致病力較低但抗藥性強 的桿菌。廣泛存在于自然界，是傷口感染較常見的一種細菌。能引起化膿性病變。感染后 因膿汁和滲出液等病料呈綠色，故名。綠膿桿菌屬假單胞菌屬（pseudomonas)，廣泛分布于 自然界及正常人皮膚、腸道和呼吸道，是臨床上較常見的條件致病菌之一。
[0003] 綠膿桿菌感染可發生在人體任何部位和組織、常見于燒傷或創傷部位、中耳、角 膜、尿道和呼吸道。也可引起心內膜炎、胃腸炎、膿胸甚至敗血癥。
[0004] 現代化戰爭中的戰傷主要是因為現代化火器造成的，因此常常伴有不同程度的燒 傷，綠膿桿菌的感染非常普遍，一旦感染往往會使創傷迀延不愈，給部隊戰斗力和后勤供給 帶來極大壓力和負擔，準確早期確診創傷是否合并綠膿桿菌感染可使創傷的治療提供可靠 依據。
[0005] 本菌為需氧或兼性厭氧菌，在普通培養基上易于生長，培養適宜溫度為35度，PH 值為7. 2。普通瓊脂形成光滑，微隆起，邊緣整齊波狀的中等大菌落。由于產生水溶性的綠 膿素（呈藍綠色）和熒光素（呈黃綠色），故能滲入培養基內，使培養基變為黃綠色。數日 后，培養基的綠色逐漸變深，菌落表面呈現金屬光澤。血液瓊脂由于綠膿桿菌能產生綠膿 酶，可將紅細胞溶解，故菌落周圍出現溶血環。
[0006] 傳統的綠膿桿菌檢測主要依據該菌的生物學特征：革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性， 能產生綠膿菌素，此外還能液化明膠，還原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42°C條件下生長等。雖然 傳統檢測方法具有一定的特異性和敏感性，但該方法操作起來費時耗力，在大規模樣品檢 測是不易推廣，另外在臨床上還有可能延誤診斷和治療。因此，研宄綠膿桿菌的快速檢測方 法具有十分重要的現實意義。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種綠膿桿菌PCR檢測試劑盒及檢 測方法，采用聚合酶鏈式反應（PCR)及Taqman熒光探針技術對綠膿桿菌基因中高保守特異 性核酸序列進行擴增檢測，以實現對綠膿桿菌的存在進行判斷，進而實現對綠膿桿菌感染 的輔助診斷。
[0008] 為實現上述目的，本發明提出如下技術方案：一種綠膿桿菌PCR檢測試劑盒，包括 待測的DNA靶基因和PCR反應液，所述PCR反應液中包括所述引物A和熒光探針A，所述引 物A分為上游引物A和下游引物A，
[0009] 所述DNA靶基因的核苷酸序列為：
[0010] 12 AGCGCAACTATCCCACTGGCGCGGAGTTCCTCGGCGACAGCGGCGACG，
[0011] 61 TCAGCTTCAACACCCGCGGCACGCAGAACTGGACGGTGGAGCGGCTGCTC，
[0012] 111CAGGCGCACCGCCAACTGGAGGAGCGCGGCTATGTGTTCGTCGGCTAC；
[0013] 所述上游引物A的核苷酸序列為：5' -AGCGCAACTATCCCACTG-3' ；
[0014] 所述下游引物A的核苷酸序列為：5' -GTAGCCGACGAACACATAG-3' ；
[0015] 所述熒光探針 A 的核苷酸序列為：5' -FAM-GGGTGITGAAGCTGACGT-BHQ-3'。
[0016] 優選地，還包括：
[0017] DNA提取液，按十二烷基硫酸鈉1%、乙基苯基聚乙二醇0. 5%濃度配制成所述DNA 提取液，充分混勻后按lmL/管分裝；
[0018] tap 酶：濃度 5u/ul，包括 10XPCR Buffer、25mmol/L MgCl2;
[0019] UNG酶：濃度> lU/y 1 ;
[0020] dNTPs :在室溫下，按體積分別為 100ul : 100ul : 100ul : 100ul : 550ul 加入 dATP、dCTP、dGTP、dUTP和超純水，攪拌混勻；
[0021] 陽性對照：106copies/mL~107copies/mL含所述DNA革巴基因片段質粒，0? 5mL/管 分裝；以及
[0022] 陰性對照：組成為1 X TE溶液。
[0023] 優選地，所述1XTE溶液的配制：稱取0. 12114g的Tris，0. 292g EDTA加入已含 60mL蒸餾水的100mL燒杯中，振搖使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸餾水洗 滌燒杯3次并移入容量瓶中，用HC1調pH值為8. 0,最后用蒸餾水定容到100ml，翻轉容量 瓶使之充分混勻。
[0024] 優選地，還包括一GAPDH內參照基因，所述內參照基因包括引物B和熒光探針B，所 述引物B分為上游引物B和下游引物B，
[0025] 所述上游引物B的核苷酸序列為：5' -TATGACAACAGCCTCAAGAT-3' ；
[0026] 所述下游引物B的核苷酸序列為：5' -AGTCCTTCCACGATACCA-3' ；
[0027] 所述熒光探針 B 的核苷酸序列為：5' -HEX-CAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGC-B HQ-3,〇
[0028] 優選地，所述熒光探針A的5'端標記FAM熒光基團，3'端標記BHQ淬滅基團；所 述熒光探針B的5 '端標記HEX熒光基團，3 '端標記BHQ淬滅基團。
[0029] 本發明還揭示一種綠膿桿菌PCR檢測方法，包括以下步驟：
[0030] S1，取一定量的所述PCR反應液、Taq UNG酶加入一個離心管中振蕩混勻，瞬時離 心后，分裝到復數管PCR反應液管中，蓋上管蓋備用；
[0031] S2,制備待測DNA樣本、陰性對照樣本和陽性對照樣本，并將制備好的所述待測樣 本、陽性對照樣本和陰性對照樣本瞬時離心后、干浴、離心，上清液用于PCR擴增；
[0032] S3,向準備好的所述PCR反應液管中分別加入所述上清液待測樣品、陰性對照樣 品、陽性對照樣品，蓋緊管蓋后瞬時離心后，將其放置于PCR儀上，編輯樣本信息按照相應 的循環參數進行擴增反應；
[0033] S4,根據相應的質控標準分析檢測結果。
[0034] 優選地，所述待測DNA樣本、陰性對照樣本和陽性對照樣本的制備：
[0035] 陰性對照樣本：取出所述陰性對照，8000r/min離心，吸取100 y 1至1. 5ml滅菌離 心管中，加入20 y 1所述內參照；
[0036] 陽性對照樣本：取出所述陽性對照，8000r/min離心，吸取100y1至1. 5ml滅菌離 心管中，加入20 y 1所述內參照；
[0037] 待測DNA樣本：用生理鹽水充分洗滌帶有創面拭子的棉簽，并擠干棉簽，將盛有棉 簽洗滌液的離心管，13000r/min離心5min，棄上清，沉淀中加入所述DNA提取液，備用。
[0038] 優選地，所述步驟S1 :確定需要進行的反應管數n，將nX44. 3 y 1綠膿桿菌PCR反 應液，nXO. 5 y 1熱啟動Taq酶和nXO. 2 y 1UNG酶加入一個離心管中并振蕩混勻，瞬時離 心后，向每一個PCR反應液管中分裝45 y 1，蓋上管蓋后轉移到加樣區，避光放于4°C冰箱備 用。
[0039] 優選地，所述循環參數包括：
[0040] 第一階段 37°C，擴增 2min ;
[0041] 94°C，擴增 5min;
[0042] 第二階段 94°C，擴增 15s ;
[0043] 60 °C，擴增 40s;
[0044] 循環40次。
[0045] 優選地，所述質控標準為同時滿足陽性質控和質控時，實驗有效，否則無效，
[0046] 所述陰性質控為：FAM通道Ct值=40或"No Ct"或"undet. "，內參照HEX通道Ct 值 < 40 ;
[0047] 所述陽性質控：FAM通道Ct值彡35,且有相應的對數增長曲線，內參照HEX通道Ct 值 < 40。
[0048] 本發明的有益效果是：
[0049] 1、本發明試劑盒具有DNA提取效果好，操作簡單、耗時短（1~2小時），結果客觀 可靠，儀器自動收集和分析數據，最低檢出限為102 C〇pieS/mL，具有靈敏度高和特異性高等 優點。
[0050] 2、本發明試劑盒使用了大腸桿菌磷酸脫氫酶基因（GAPDH基因）作為內參照基因， 它在綠膿桿菌基因組和人類基因組中均無同源基因，因此可作為內參照以檢測每次PCR反 應中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結果的可信性。
【附圖說明】
[0051] 圖1是本發明綠膿桿菌PCR檢測方法的流程示意圖；
[0052] 圖2是本發明綠膿桿菌基因靈敏度檢測結果示意圖；
[0053] 圖3是本發明綠膿桿菌基因精密度結果示意圖；
[0054] 圖4是本發明綠膿桿菌基因特異性結果示意圖。
【具體實施方式】
[0055] 下面將結合本發明的附圖，對本發明實施例的技術方案進行清楚、完整的描述。
[0056] 本發明揭示了一種綠膿桿菌PCR檢測試劑盒和檢測方法，采用PCR反應及Taqman 熒光探針技術對綠膿桿菌基因中高保守特異性核酸序列進行擴增檢測，從而判斷綠膿桿菌 的存在與否，指導戰地醫生對綠膿桿菌感染的病人用藥，幫助愈后判斷。
[0057] 內參照原理：本發明試劑盒設置了內參照，該內參照為含管家基因：磷酸脫氫酶 基因（GAPDH基因）的質粒，GAPDH基因是一種管家基因，在人體細胞中能穩定表達，進行綠 膿桿菌核酸提取時，能同步有效得到，因此可作為內參照以檢測每次PCR反應中是否有PCR 抑制物存在，從而確保PCR結果的可信性。當內參照結果為陽時，表示PCR反應體系以及操 作正常；因此當目的基因結果為陰時，內參照結果為陽就顯得十分重要了；但當目的基因 結果為陽時，內參照的擴增曲線較目的基因擴增曲線要推遲，或是內參照結果為陰都是正 常的；然而目的基因和內參照基因結果都為陰時，該實驗視為無效，需再重復。
[0058] 陽性對照原理：每次試驗都需同時做陽性對照。陽性對照結果為陽