一種家豬印記基因Rasgrf1的鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學領域，特別是涉及一種家豬印記基因Rasgrfl的鑒定方 法。
【背景技術】
[0002] 基因組印記是一種表觀遺傳現象，印記基因具有單等位表達和親本特異性。通過 每個染色體的印記可以對其親本來源進行判斷。然而印記標記的機制研宄表明，DNA甲基 化在基因組印記現象中起重要作用，因此甲基化動態和印記機制成為研宄熱點。大部分印 記基因成簇存在，絕緣子調控模型或長鏈非編碼RNAs調控模型對其表達進行調控。越來越 多的證據表明DNA甲基化不僅僅與印記基因表達相關，同時，印記基因的表達調控還與翻 譯后組蛋白修飾有關。
[0003] 目前，對基因組印記的研宄主要集中在人和鼠中，而在家畜，特別是豬上的研宄較 少。因此在豬上鑒定印記基因對于基因組印記在物種間的保守性研宄具有重要意義。此 外，家畜大多數印記基因是調控生長發育的主效基因，這些基因對胚胎早期發育、出生后的 生長速度、產肉量、瘦肉率、飼料效率等數量性狀有極大影響。基于印記基因在生長和發育 中的重要調控作用，鑒定出新的豬印記基因是一個值得探討的新課題。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種效果理想、成本低、操作簡便的家豬印記基 因Rasgrfl的鑒定方法。
[0005] (1)采用PCR-SSCP-PAGE的方法查找Rasgrfl基因外顯子序列SNP (single nucleotide polymorphism,單核苷酸多態性）：
[0006] I.提取皖南黑豬和巴克夏豬的DNA，進行Rasgrfl基因外顯子1和外顯子14部分 序列的克隆；
[0007] II. PCR-SSCP 方法分型；
[0008] III.不同基因型個體PCR產物的純化、克隆和測序。
[0009] (2)總RNA的提取和cDNA的制備：
[0010] I.正反雜交模型的建立：正交：巴克夏豬6 X皖南黑豬早；反交：皖南黑豬古X 巴克夏豬早；巴克夏豬6與皖南黑豬早交配產生的F1代仔豬為正交F1，皖南黑豬6與巴克 夏豬早交配產生的F1代仔豬為反交F1 ;
[0011] II. SNP位點雜合個體的篩查：出生1日齡的正反交F1代仔豬各8頭，分別提取各 親本以及F1代仔豬個體的基因組DNA，用于雜合子鑒定；采用PCR-RFLP方法，基于步驟（1) 查找到的SNP位點，該SNP位點處雜合基因型的個體為F1代雜合子仔豬個體；
[0012] III.總RNA的提取和cDNA的制備：提取F1代1日齡正反交仔豬各8頭以及雜合 子仔豬7頭的14種不同組織的RNA，反轉錄成cDNA ;7頭雜合子仔豬中包括正交3頭，反交 4頭；14種不同組織為腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、胰臟、背膘、睪丸、子宮、小腸、背 最長肌和垂體；
[0013] (3)采用RT-PCR-RFLP方法鑒定印記狀態
[0014] I. RT-PCR-RFLP 鑒定印記狀態：
[0015] 取F1代1日齡正交3頭、反交4頭雜合子仔豬的14種不同組織cDNA，利用錨定引 物進行RT-PCR ;采用RT-PCR-RFLP方法檢測雜合子仔豬各組織器官mRNA酶消化帶型，并根 據其親本的基因型判斷Rasgrfl基因在特定階段和組織是父系印記還是母系印記或者不 存在印記；所述錨定引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2所示；
[0016] II.q-RT-PCR
[0017] 取F1代1日齡正反交仔豬各8頭的14種不同組織cDNA，利用錨定引物進行 q-RT-PCR，檢測Rasgrfl基因在14個組織，即腦、心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、胰臟、背 膘、睪丸、子宮、小腸、背最長肌和垂體的mRNA表達水平；所述錨定引物對應的核苷酸序列 如序列表中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；
[0018] (4)目的基因蛋白水平的檢測
[0019] 取F1代1日齡正交3頭、反交4頭雜合子仔豬，選取其Rasgrfl基因雙等位基因 表達的兩種組織心和脾，單等位基因表達的兩種組織肝和小腸進行Rasgrfl基因編碼的蛋 白質分布的研宄，包括石蠟組織切片的制作和免疫熒光觀察兩大步驟；
[0020] (5)亞硫酸氫鹽修飾后測序的甲基化分析方法
[0021] 通過對豬Rasgrfl基因啟動子活性的分析，預測核心啟動子區和該片段內CTCF結 合區域，經軟件預測確定此兩區域GpG島的分布情況；樣品經過亞硫酸鹽處理后，通過設計 特異性引物對其進行PCR擴增，而后測序進行基因甲基化程度分析。
[0022] 本發明所述的家豬印記基因Rasgrfl的鑒定方法，其中，步驟（4)中石蠟組織切片 的制作具體包括如下步驟：
[0023] (1)固定：脾在新鮮配制的Bouin溶液中固定24h，其他組織在10%中性甲醛固定 液固定24h ;
[0024] (2)脫水：使用濃度逐級升高的梯度乙醇依次脫水，30%- 50%- 60%- 70% -80% - 90% - 95% I、II -無水乙醇 I、II，各 60min ;
[0025] (3)透明：體積比為1 : 1二甲苯無水乙醇混合液20min-二甲苯I、II，各 lOmin ；
[0026] (4)浸蠟：體積比為1 : 1二甲苯石蠟混合液lh -石蠟I、II，各lh ;
[0027] (5)包埋：將溶化的石蠟倒入包埋盒內，用鑷子將浸蠟徹底的組織塊放入，蠟塊大 小滿足切片需要、便于切片機固定和切片；
[0028] (6)切片：組織塊制成蠟塊，穩固置于切片機上即可開始切片，厚度為6 ym ;
[0029] (7)展片：展片溫度控制在43°C以下；
[0030] 免疫熒光：
[0031] (1)烤片溫度為 6(TC，2-8h ;
[0032](2)二甲苯I、II脫蠟各 15min;
[0033] (3)梯度酒精復水：100%酒精1、11各101^11 - 95%酒精1、11各10111111 - 80% 酒精51^11 - 70%酒精5111111 - 50%酒精5111111-蒸餾水3111111\2次一？83 5111111;
[0034](4)抗原修復：切片置于枸櫞酸修復液中，100%火力3min至微微沸騰一50%火力 維持7min -停止加熱自然冷卻30min ;
[0035] (5)封閉：PBS 3min，濾紙擦去標本外的PBS -滴加封閉血清1 % BSA -濕盒中 37°C封閉30min -濾紙擦去封閉液；
[0036] (6)-抗：滴加200 yL體積比為1:100稀釋的兔抗人Rasgrfl蛋白多克隆抗體， 4°C孵育過夜一PBS 3minX5次洗去一抗，濾紙擦去標本外的PBS ;
[0037] (7)二抗：滴加200yL體積比為1:100稀釋的熒光標記山羊抗兔IgG，室溫孵育 lh - PBS 3minX5次洗去二抗，濾紙擦去標本外的PBS ;
[0038] (8)染核：滴加PI避光孵育8min - PBS3minX3次洗去PI，濾紙擦去標本外的 PBS ；
[0039] (9)甘油封片，立即在共聚焦顯微鏡下觀察。
[0040] 本發明所述的家豬印記基因Rasgrfl的鑒定方法，其中，步驟（5)中甲基化分析方 法具體包括如下步驟：
[0041] DNA修飾（根據Milli-pore甲基化試劑盒說明書），具體步驟如下：
[0042] (l)DNA 修飾：
[0043] 100 y L含1. 0 y g DNA溶液中加入7. 0 y L 3mol/L的氫氧化鈉，充分混勻；50°C孵 育DNAlOmin后加550 y L現配的DNA修飾試劑I，渦旋；50°C避光孵育16h;
[0044](2)首次脫鹽
[0045] 在DNA溶液中加入5 y L充分渦旋重懸DNA修飾試劑III，再加入750 y L DNA修飾 試劑II，混勻；室溫孵育10min，5000g離心10s，棄上清；加1.0mL70%乙醇，渦旋，5000g離 心l〇s，棄上清，重復三次；第三次棄上清后，高速離心2min，吸去上清；
[0046] (3)第二次脫鹽
[0047] 在上述沉淀中加入50yL 20mmol/L Na0H/90%乙醇，渦旋重懸顆粒于室溫孵育 5min ;5000g離心10s，收集內容物于管底；加1.0ml 90 %乙醇，渦旋洗滌顆粒，離心，棄上 清，重復一次；第二次洗滌，棄上清后高速離心3min，吸凈上清，室溫干燥20min ;加TE緩沖 液，50-60°C孵育樣品15min，洗脫DNA，高速離心3min，將上清轉入新的PCR管，分裝-20°C 保存；
[0048] 甲基化特異性PCR引物設計：
[0049] 通過甲基化預測網站（www. ebi. ac. uk/emboss/cpgplot/)預測豬Rasgrfl基因上 游2kb左右區域的CpG島的分布情況，用甲基化在線軟件MethPrimer設