用于檢測結腸直腸癌的sdc2甲基化的制作方法
【專利說明】
[0001] 本申請是中國專利申請201080056594. 8的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及用于檢測結腸直腸癌診斷用的結腸直腸癌特異性甲基化標志物基因 的甲基化的方法，尤其涉及檢測結腸直腸癌特異性標志物基因的方法，該基因在結腸直腸 癌細胞中被特異性地甲基化，從而為診斷結腸直腸癌提供信息。
【背景技術】
[0003] 即便是在醫學科學進步的當今時代，癌癥患者，尤其是實體瘤患者（不同于血液 癌患者）的5年生存率也低于50%，且全部癌癥患者中的大約2/3都在晚期確診，并且幾乎 全都在癌癥診斷后的兩年內去世。癌癥治療中這樣的糟糕結果不僅是治療方法的問題，還 歸因于早期癌癥診斷、晚期癌癥的確診以及對癌癥治療后癌癥患者的后續追蹤的不易。
[0004] 目前的臨床實踐中，經病史詢問、身體檢查和臨床評估，如果疑似患有癌癥，再以 放射線檢測和內窺鏡檢查，之后才通過組織活檢確診為癌癥。然而，只有當癌細胞數量超過 十億，且癌直徑大于lcm時，通過現有的臨床實踐診斷癌癥才是可能的。這種情況下，癌細 胞已經具備了轉移能力，并且其中至少半數已經轉移。同時，用于監測由癌癥直接或間接產 生的物質的腫瘤標志物被用于癌癥篩查，但它們由于準確性有限會造成干擾，因為其中多 達半數的腫瘤標志物甚至在癌癥存在的情況系下也表現為正常，卻經常在甚至未患癌癥的 情況下表現為陽性。另外，主要用于癌癥治療的抗癌劑具有只在癌體積較小時才有效的問 題。
[0005] 癌癥難以診斷和治療的原因在于，癌細胞的高度復雜性和可變性。癌細胞過度且 持續生長，侵害周圍組織，并轉移至遠端器官，導致死亡。盡管有免疫機制的攻擊或抗癌治 療，癌細胞依然存活，持續發展，且最適于存活的細胞群選擇性繁殖。癌細胞是具有高度生 存力的活體，它的發生是由大量基因的突變所致。為使一個細胞轉變成癌細胞，并發展成臨 床可檢測的惡性癌瘤塊，必須發生大量基因突變。因此，為了從根本上診斷和治療癌癥，需 要基因水平的治療途徑。
[0006] 近來，人們積極地嘗試遺傳分析技術來診斷癌癥。最簡單的典型方法是用PCR檢 測血液中ABL:BCR融合基因（白血病的遺傳特征）的存在。該方法準確率超過95%，且在 使用這一簡單易行的遺傳分析來診斷和治療慢性粒細胞白血病后，該方法還被用于結果評 估和后續研究。然而，該方法的缺陷在于，其只能用于某些血液癌。
[0007] 此外，還嘗試過另一種方法，其中使用RT-PCR和印跡技術來檢測癌細胞表達基 因的存在，從而診斷血細胞中癌細胞的存在。然而，該方法的缺點在于，它只能用于一些 癌癥，包括前列腺癌和黑色素瘤，且假陽性率高。另外，該方法中難以標準化檢測和讀取， 其效用也有限（Kopreski，M.S.et al.，Clin. Cancer Res.，5:1961，1999 ;Miyashiro，I.et al.，Clin. Chem.，47:505, 2001)。
[0008] 近來，人們積極地嘗試了使用血清或血漿中DNA的基因檢測方法。這是一種檢 測癌癥相關基因的方法，所述癌癥相關基因分離自癌細胞并釋放入血液中，并在血清中以 游離DNA形式存在。據發現，實際癌癥患者血漿中DNA的濃度是正常人的5-10,這些增加 的DNA大多數由癌細胞釋放。利用這些分離自癌細胞的DNA，分析癌癥特異性基因的異常， 例如突變、缺失以及原癌基因（oncogene)和腫瘤抑制基因的功能缺失，可以診斷癌癥。在 這方面，人們已有積極的嘗試，通過檢測血清中突變K-Ras原癌基因、p53腫瘤抑制基因和 P16基因的啟動子甲基化，以及微衛星的標記和不穩定性，用以診斷肺癌、頭頸癌、乳腺癌、 結腸直腸癌及肝癌（Chen, X.Q.et al.，Clin. Cancer Res. ,5:2297, 1999 ;Esteller，M.et al.，Cancer Res.，59:67, 1999 ;Sanchez_Cespedes，M.et al.，Cancer Res.，60:892, 2000; Sozzi,G. et al. , Clin. Cancer Res. ,5:2689, 1999) 〇
[0009] 同時，在除血液之外的樣品中也能檢測到癌細胞的DNA。在一種已嘗試的方法 中，通過基因或抗體測試來檢測肺癌患者的痰或支氣管肺泡灌洗液中癌細胞或原癌基因 的存在（Palmisano，W.A.et al.，Cancer Res.，60:5954, 2000 ;Sueoka，E.et al.，Cancer Res. ,59:1404, 1999)。另外，已有檢測結腸和直腸癌患者糞便中原癌基因的存在 (Ahlquist, D. A. et al.，Gastroenterol.，119:1219-27, 2000)和檢測尿液和精液中啟動子 甲基化異常（Goessl，C.et al.，Cancer Res.，60:5941，2000)的其他方法的嘗試。然而，為 了準確地診斷導致大量基因異常并表現出各種癌癥不同的突變特征的癌癥，需要一種以準 確且自動化的方式同時分析大量基因的方法。然而，上述方法尚未建立。
[0010] 因而，最近提出了通過檢測DNA甲基化來診斷癌癥的方法。當某基因的啟動子CpG 島高度甲基化時，該基因的表達沉默。這被解釋為該基因喪失功能的主要機制，即便活體中 所述基因的蛋白質編碼序列并無突變。另外，這也被分析為是導致人類癌癥中一些腫瘤抑 制基因功能喪失的因素。因此，對腫瘤抑制基因啟動子CpG島的甲基化分析非常有助于癌 癥研究。已有通過例如甲基化特異性PCR(下文中稱為"MSP"）或自動堿基測序的方法來分 析所述啟動子CpG島的甲基化，并將分析結果用于癌癥診斷和篩查的積極嘗試。
[0011] 相當數量的疾病是由基因異常造成的，而基因異常最常見的形式是基因編碼序列 的改變。這種遺傳性改變稱為突變。當任何基因中發生突變時，該基因編碼的蛋白質的結 構和功能發生改變，導致異常和缺失，并且該突變的蛋白質會引起疾病。然而，特定基因的 表達異常也會引起疾病，即便所述基因中并未發生突變。這其中一個典型的例子是甲基化， 其中甲基偶聯至基因的轉錄調控區域，即所述啟動子CpG島的胞嘧啶堿基，這種情況下，所 述基因的表達沉默。這就是所謂的表觀遺傳變化（epigenetic change)。這種變化傳遞給 后代，導致相關蛋白質以與突變相同的方式表達缺失。最典型地，癌細胞中腫瘤抑制基因 由于啟動子CpG島的甲基化而表達沉默，導致癌變（Robertson, K.D.et al.，Carcinogens is, 21:461，2000)。
[0012] 對于癌癥確診而言，重要的是不僅檢測突變基因，而且檢測該基因發生突變的機 制。之前的研究集中于編碼序列中的突變，即微觀變化，例如點突變、缺失和插入，或宏觀的 染色體異常。然而，近年來，表觀遺傳變化據報導與這些突變同等重要，所述表觀遺傳變化 的典型例子是所述啟動子CpG島的甲基化。
[0013] 哺乳動物細胞的基因組DNA中，除了 A、C、G和T外還有第五種堿基，即5-甲基胞 嘧啶，其中甲基偶聯到所述胞嘧啶環的第5個碳上（5-mC)。5-mC總是只與CG二核苷酸中 的C偶聯（5' -mCG-3'），這常被標識為CpG。CpG的C通常由于偶聯著甲基而被甲基化。這 種CpG的甲基化抑制了基因組中重復序列，例如Alu或轉座子，的表達。另外，這種CpG是 哺乳動物細胞中表觀遺傳變化最頻發的位點。這種CpG的5-mC經天然脫氨成為T，因而哺 乳動物基因組中的所述CpG僅表現出1%的頻率，遠遠低于正常頻率（l/4xl/4 = 6. 25% )。
[0014] CpG異常集中的區域被稱為CpG島。所述CpG島是指長度在0. 2-3kb，C+G含量超 過50%，且CpG比例高于3. 75%的位點。人類基因組中約有45,000個CpG島，大多見諸于 調控基因表達的啟動子區域。實際上，CpG島存在于占人類基因約50%的管家基因的啟動 子上（Cross, S. et al.，Curr. Opin. Gene Develop.，5:309, 1995)。
[0015] 同時，正常人的體細胞中，這種管家基因啟動子位點的CpG島是未甲基化的，而印 記基因（imprinted gene)和失活的X染色體上的基因被甲基化，使所述基因在發育過程中 不表達。
[0016] 致癌過程中，甲基化見諸于啟動子CpG島中，并限制相應基因的表達。特別地， 如果甲基化發生在腫瘤抑制基因的啟動子CpG島中，所述基因調控細胞周期或凋亡，修復 DNA，參與細胞粘著和細胞間相互作用，和/或抑制細胞侵襲和轉移，則這種甲基化以與編 碼序列的突變相同的方式阻斷了所述基因的表達和功能，從而促進了癌癥的發生發展。另 外，由于衰老所述CpG島中還會發生部分甲基化。
[0017] 一個有趣的事實是，在基因突變會導致先天癌癥的癌癥發展但所述基因的突變不 會發生在獲得性癌癥中的情況下，所述基因的啟動子CpG島的甲基化代替了突變。典型 的例子包括所述基因的啟動子甲基化，例如獲得性腎癌VHL(von Hippel Lindau)、乳腺癌 BRCA1、結腸直腸癌MLH1以及胃癌E-CAD。另外，所有癌癥中的約半數均發生了 pl6啟動子 甲基化或Rb突變，而其余癌癥則表現出p53突變或p73、pl4及類似基因的啟動子甲基化。 [0018] 一個重要的事實是，啟動子甲基化引起的表觀遺傳變化導致了遺傳變化（即，編 碼序列突變），并且癌癥的發展被所述遺傳和表觀遺傳變化的結合共同推進。例如在MLH1 基因中，存在如下情況：在結腸直腸癌細胞中MLH1基因的一個等位基因由于基因突變或缺 失而功能喪失，而剩下的一個等位基因由于啟動子甲基化而不發揮功效。另外，如果MLH1， 即一種DNA修復基因，的功能由于啟動子甲基化而喪失，則其他重要基因的突變發生有助 于促進癌癥的發展。
[0019] 大多數癌癥表現出與CpG有關的三種共性，即，腫瘤抑制基因的啟動子CpG島的 高度甲基化，剩余CpG堿基位點的低甲基化（hypomethylation)，以及甲基化酶即DNA胞 嘧啶甲基轉移酶 ONMT)的活性增加（Singal, R. &Ginder, G. D.，Blood, 93:4059, 1999 ; Robertson, K. et al.，Carcinogensis, 21:461，2000 ;Malik，K. &Brown, K. W.，Brit. J. Cancer, 83:1583, 2000)〇
[0020] 當啟動子CpG島被甲基化時，相應基因的表達被阻斷的原因并未清楚地建立起 來，但據推測是因為甲基化CpG結合蛋白（MECP)或甲基化CpG結合域蛋白（MBD)以及組 蛋白去乙酰化酶與甲基化的胞嘧啶相結合，從而造成染色體的染色質結構改變和組蛋白改 變。
[0021] 究竟啟動子CpG島甲基化是直接造成癌癥的發展，還是作為癌癥發展后的次生變 化仍然未確定。然而，明確的是，腫瘤相關基因的啟動子甲基化是癌癥的重要指標，并因而 能用于許多應用，包括癌癥的診斷和早期檢測、癌癥發展風險的預估、癌癥預后、治療后的 后續檢查以及對抗癌治療反應的預估。近來，人們進行了積極嘗試，檢查血液、痰、唾液、 糞便或尿液中的腫瘤相關基因的啟動子甲基化，并將檢查結果用于各種癌癥的診斷和治 療（Esteller, M. et al. , Cancer Res. , 59:67, 1999 ；Sanchez-Cespedez,M.et al. , Cancer Res.,60:892, 2000 ；Ahlqu