一種編碼irisin蛋白的核酸分子以及利用該核酸分子高效表達irisin蛋白的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程技術領域，具體地說是一種編碼irisin蛋白的核酸分子以及利用該核酸分子高效表達irisin蛋白的方法。
【背景技術】
[0002]Irisin (鳶尾素)是2012年初由Pontus Bostrom團隊發現的一種新的激素。研究發現，運動首先誘導骨骼肌表達PGC-1 α，后者可促進FNDC-5基因的表達，隨后FNDC5在體內被剪切轉變為一種新的形勢一irisin。其從骨骼肌合成分泌后，通過血液循環作用于白色脂肪細胞，使其轉化為具有分解代謝脂肪特征的棕色脂肪細胞，脂肪分解代謝產生的能量以熱的形式散發。
[0003]Moreno - Navarrete研究標明，Irisin可誘導人體脂肪組織棕色化,從而改善脂肪組織的功能并增加FNDC-5基因的表達，因而irisin在脂肪組織的生成形成了正反饋。另夕卜，還發現irisin可促進糖脂代謝，以增加能量消耗、降低體質量。Irisin促進白色脂肪組織棕色化，并產生致熱作用，可以靶向治療肥胖及肥胖相關代謝疾病，從而減低II型糖尿病(T2DM)的危險因素。
[0004]胰島素抵抗和胰島β細胞功能受損是導致T2DM發生、發展的主要因素。Irisin可能通過以下方面來增強外周組織(骨骼肌、脂肪組織)及肝臟對胰島素作用的敏感性，同時對胰島β細胞也可能具有保護作用。
[0005]研究表明irisin作為AMPK激活后PGC-1 α的表達產物，可能參與了 BCL2所調控的骨骼肌細胞內自噬作用，從而增加骨骼肌的胰島素敏感性。
[0006]研究表明irisin很可能通過抑制FSP27的表達來改善脂肪組織對胰島素的敏感性。
[0007]研究表明irisin可能通過上調肝內纖維母細胞生長因子21 (FGF21)來改善肝臟的胰島素敏感性。
[0008]Irisin具有明顯減肥和改善胰島素抵抗作用，而且小鼠和人體irisin的同源性為100%，這些研究為體外合成irisin重組蛋白做為運動激素，去發揮運動產生的功能、減肥降糖提供了可能。重要的是，肥胖、T2DM患者體內irisin水平都較低，提示這種由PGC-1 α促分泌的激素irisin將可能成為人類治療肥胖、T2DM等相關代謝性疾病的有效蛋白質類藥物。
[0009]如何制得編碼irisin的核酸分子和獲得該編碼irisin的核酸分子的高效表達產物是現代化生物醫學亟待解決的一項重要課題。
【發明內容】
[0010]本發明的技術任務是解決現有技術的不足，提供一種編碼irisin蛋白的核酸分子以及利用該核酸分子高效表達irisin蛋白的方法。
[0011]本發明的技術方案是按以下方式實現的，一種編碼irisin蛋白的核酸分子，其序列為以下核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1所示的核苷酸序列；
(2)SEQID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一個或多個核苷酸的具有至少40%序列一致性的同源序列；
(3)在嚴格條件下，與(I)或(2)的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；
(4)由于遺傳密碼子的簡并性區別于(3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
[0012]一種irisin蛋白，其序列為以下氨基酸序列之一:
(1)SEQID N0.2所示的氨基酸序列；
(2)SEQID N0.2所示的氨基酸序列添加、取代、缺失或插入一個或多個氨基酸的具有至少40%序列一致性的同源序列。
[0013]一種擴增irisin蛋白的核酸分子的核苷酸序列所設計的引物，上游引物和下游引物的序列分別為以下核苷酸序列:
上游引物 EcoR1-F: SEQ ID N0.3 ；
下游引物 Xba1-R: SEQ ID N0.4。
[0014]上游引物EcoR1-F的序列中包含有及^I限制性酶切位點；
下游引物Xba1-R的序列中包含有ZhZP艮制性酶切位點。
[0015]一種重組質粒，該重組質粒的核苷酸序列包含有SEQ ID N0.1。
[0016]一種重組受體細胞，該重組受體細胞中包含有上述的重組質粒。
[0017]該重組受體細胞中含有的重組質粒能夠表達SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列的蛋白。
[0018]一種利用編碼irisin蛋白的核酸分子高效表達irisin蛋白的方法,其方法步驟是:
(一)優化:
根據最終所表達選取的是受體細胞的類型，則對目的基因進行優化；
密碼子優化:
由于宿主中可能包含抑制目的蛋白表達的因子，缺乏識別常用的密碼子tRNA，故在外源宿主中很難高表達，通過保持密碼子的使用頻率與同源tRNA之間的平衡、將目的基因低利用率密碼子替換為宿主受體細胞常用密碼子、去除低利用率的密碼子或者容易被誤讀為終止信號的密碼子優化基因設計，獲得能夠在受體細胞中具有較高蛋白表達量的基因序列；
獲得優化的irisin基因序列SEQ ID N0.1 ；
RNA 二級結構優化:
由于N端核苷酸序列的蛋白表達對于低利用率密碼子和接近起始位點的密碼子AUG非常敏感，翻譯與mRNA的穩定性間也存在著相互的影響,穩定mRNA 二級結構和接近5’端的分子也對基因表達有重要的影響，通過對RNA 二級結構、翻譯起始位點的優化，消除RNA的發卡的結構，平衡GC和AT的分布，最終獲得高表達量的基因重組受體細胞菌株；
(二)構建表達載體:
Irisin基因的DNA和/7/1/聚合酶用于PCR反應中，根據irisin基因的5 ’和3’的序列設計引物，
上游引物 EcoR1-F: SEQ ID N0.3 ；
下游引物 Xba1-R: SEQ ID N0.4 ；
上游引物、下游引物中還分別含有EcoRi和XbaV限制性酶切位點，將irisin基因的PCR產物克隆到pPICZ a A載體中，得到重組質粒pPICZ_Iri ；
(三)構建含有irisin基因的重組受體細胞:
將具有irisin基因的重組質粒pPICZ_Iri轉化到受體細胞中，從重組受體細胞轉化子中提取質粒驗證重組受體細胞中表達的irisin蛋白為SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列:
(四)驗證:
驗證重組受體細胞所表達的irisin蛋白序列；
(五)表達:
被轉化的重組受體細胞在30°C ±5°C環境，在含有質量濃度0.1%?5%的甲醇的細胞培養基中培養，離心，收集上清液，獲得irisin蛋白。
[0019]所述的受體細胞采用畢赤酵母。
[0020]所述的驗證步驟是:
提取重組受體細胞中的質粒，可以通過以下兩方面中的任一或共同驗證重組受體細胞中表達的irisin蛋白為SEQ ID N0.2所不的氣基酸序列:
(1)一方面:以所提質粒為模板，特異性引物EcoR1-F，Xba1-R擴增irisin基因，進行測序，確定和驗證目的基因的序列；
(2)另一方面:用所提質粒轉化大腸桿菌DH5a中，提取質粒，通過和酶切，同時將提取的質粒進行測序，確定和驗證目的基因的序列。
[0021]所述irisin蛋白在制備防治肥胖癥的藥物中應用
所述irisin蛋白在制備防治II型糖尿病相關代謝性疾病的藥物中應用。
[0022]本發明與現有技術相比所產生的有益效果是:
一種編碼irisin蛋白的核酸分子以及利用該核酸分子高效表達irisin蛋白的方法，利用基因工程技術，優化基因序列設計，改良RNA 二級結構，成功地構建了高效表達菌株，首次實現irisin在真核系統中的表達。通過基因工程菌的代謝發酵分泌irisin蛋白。Irisin蛋白是由111個氨基酸殘基組成的N-糖基化蛋白質激素，分子量約為32KDa，去糖基化后分子量約為12KDa。Irisin必將是一個很有前景的活性因子，并成為代謝性疾病及其伴發癥防治的新靶點。對于肥胖癥和糖尿病的治療具有重要的意義。
【附圖說明】
[0023]附圖1是本發明的技術路線示意圖；
附圖2是本發明的irisin蛋白進行純化，SDS-PAGE電泳結果示意圖；
附圖3是本發明的發酵過程中，不同濃度的甲醇誘導irisin蛋白表達量的變化坐標示意圖。
【具體實施方式】
[0024]下面對本發明的一種編碼irisin蛋白的核酸分子以及利用該核酸分子高效表達irisin蛋白的方法作以下詳細說明。
[0025]本發明的一種編碼irisin蛋白的核酸分子以及利用該核酸分子高效表達irisin蛋白的方法: