一種防治果樹rna病毒的方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種防治果樹RNA病毒的方法。
【背景技術】
[0002] 果樹病害主要是真菌病害，細菌病害和病毒病害（包括病毒、類病毒、類立克次 體、類細菌等）三大類。目前人們對病毒病害認識還不足，重視不夠。隨著全球果樹業的發 展，果樹面積不斷擴大，果樹病毒病害對長期采用營養繁殖的果樹危害面積和程度也越來 越大，造成許多果樹生長不良，產量下降，品質變劣，樹體表現出許多不正常現象，給果樹生 產帶來巨大的經濟損失，而且該損失仍有不斷蔓延的趨勢。
[0003] 蘋果裡綠葉斑病毒（Apple chlorotic leaf spotvirus，ACLSV)、蘋果莖溝病毒 (Apple stemgrooving virus，ASGV)和蘋果莖痕病毒（Apple stem pitting virus，ASPV) 是危害蘋果樹和梨樹的三大主要病毒，三者均為RNA病毒。ACLSV、ASPV和ASGV在寄主上 呈現不表現癥狀，即外觀上無明顯癥狀，故又稱為潛伏侵染，不易被人發現，只有在對該病 毒非常敏感的指示植物上才能表現出特有癥狀。ACLSV、ASGV和ASPV幾乎存在于所有蘋果 和梨產區，有些蘋果和梨品種的潛帶率已經飽和，20世紀50年代困擾日本果樹界的富士蘋 果高接病被證實是由ACLSV、ASPV和ASGV單獨或復合侵染造成的。20世紀80年代在我國 的一些果產區中也發現ACLSV、ASPV和ASGV常在一定的砧穗組合上引起嫁接不親和，此外， 還可引起枝條生長異常，枝條稀疏，樹勢衰退，造成嚴重減產，果品質量受到惡劣影響。
[0004] 蘋果樹和梨樹的病毒病害屬于難治療病害，多年來人們還沒有研制出一種有效的 防治藥劑，較為可行的控制措施是培育無病毒苗和無毒化栽培，無毒苗培育常采用微莖尖 組織培養結合熱處理技術，同時配合靈敏、高效、專一的檢測方法，而無毒化栽培則需要在 無毒苗培育的基礎上輔以嚴格的園地選擇、整形修剪、肥水管理等一系列繁瑣、復雜的栽培 條件，給蘋果和梨病毒病的防治工作帶來了巨大的困難，不僅防治工作量大，復雜繁瑣，而 且防治成本極高。
[0005] RNA干擾技術（RNAi)是近幾年發展起來的一種非常先進的分子生物學技術，廣泛 應用于大規模的功能基因組解析、抗病以及生長發育的調控等方面。作為實現RNA干擾的 一種手段，siRNA在生物體內有著誘發RNA干擾的作用，由此達到抑制病毒、防治病毒病的 效果。目前RNA干擾技術在線蟲、果蠅以及植物中的應用已取得了很多成果，在哺乳動物中 的研宄和應用也已取得長足進展。RNA介導的基因沉默是植物在基因調控水平上的自我保 護機制，在對抗病毒侵染、DNA侵入、DNA轉座和重排中發揮重要作用，具有普遍性。
【發明內容】
[0006] 本發明為解決現有技術中果樹病毒病害防治方法繁瑣、復雜等問題，提供了一種 以現代生物技術為基礎，操作簡便、速度快、成本低、起效快、實時性強的防治果樹RNA病毒 的方法。
[0007] 本發明的發明點在于：將RNAi引入蘋果和梨病毒病害的防治，根據ACLSV、ASPV和 ASGV外殼蛋白基因的部分保守序列設計ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA。利用植物氣孔及 其表皮細胞吸收siRNA，siRNA進入細胞后，通過RNA干擾原理降解了病毒外殼蛋白基因的 mRNA，使得病毒無法復制，起到了抑制病毒、防治病毒病的效果。
[0008] 本發明的第一個目的是保護一種防治果樹RNA病毒的siRNA序列，ACLSV的siRNA 序列如SEQ ID NO. 1所示，ASGV的siRNA序列如SEQ ID NO. 2所示，ASPV的siRNA序列如 SEQ ID NO. 3 所示。
[0009] 本發明的另一個目的是保護一種防治果樹RNA病毒的方法，包括以下步驟：
[0010] (1)根據ACLSV、ASPV和ASGV外殼蛋白基因的部分保守序列設計ACLSV、ASPV和 ASGV 的 siRNA ;
[0011] 所述的 ACLSV 的 siRNA 序列為：5' -UUGGAGUUCAAUAAGGGUCUG-3'，
[0012] ASGV 的 siRNA 序列為：5' -AACCUGGGUCGCGGUCUUGGAC-3'，
[0013] ASPV 的 siRNA 序列為：5' -ACUGAGCGGUGUACGUUGAGGCA-3' ；
[0014] (2)配制濃度為 0? 1 y mol/L ~1. 2 y mol/L 的含 ACLSV、ASPV 和 ASGV 的 siRNA 雙 蒸水混合溶液；其中ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA的質量配比為1:1:1 ;
[0015] (3)向ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA雙蒸水混合溶液中加入展著劑吐溫-80,其中 展著劑吐溫-80的體積百分數為1 %~10% ;
[0016] (4)將步驟（3)所得混合液噴施在果樹的葉片表面，溶液噴布細致、周到。
[0017] 進一步的，所述步驟（4)在每年的6~8月果樹生長旺盛時期，向果樹的葉片表面 噴施步驟（3)所得混合液。
[0018] 進一步的，所述果樹為蘋果樹或梨樹。
[0019] 本發明采用已建立的RT-PCR體系對噴施過siRNA混合溶液的蘋果樹和梨樹進行 ACLSV、ASPV和ASGV的檢測，檢測結果表明實驗前的樹體中均攜帶ACLSV、ASPV和ASGV，而 實驗后于不同時間取樣檢測的結果均表明樹體中已經不攜帶ACLSV、ASPV和ASGV。由此證 明，本發明已取得了很好的防治效果，作為一種操作方法簡便、效果明顯、使用成本低的蘋 果和梨病毒病防治方法，采用RNAi防治蘋果和梨病毒病具有良好的應用前景。
[0020] 本發明與現有技術相比，有益效果在于：（1)首次采用RNA干擾技術防治ACLSV、 ASPV和ASGV病毒病；(2)首次合成ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA ; (3)采用葉面噴施法，用 體積百分數1~10%的吐溫-80 (Tween-80)作為展著劑，將ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA 引入蘋果樹和梨樹體內；(4)本發明操作方法簡便，速度快，實時性強，效果明顯，使用成本 低，易于推廣。
【具體實施方式】
[0021] 下面結合實施例，對本發明作進一步描述。以下實施例僅用于說明本發明而非用 于限定本發明的范圍，實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規方法操作。
[0022] 實施例1~6中，每個實施例選擇的平果樹品種有：紅富士、金冠、新紅星、喬納金 和秦冠共5個品種，每個品種選擇5株樹，總計150株海個實施例選擇的梨樹品種有：三季 梨、巴梨和鴨梨共3個品種，每個品種選擇5株樹，總計90株。
[0023] 在實驗前，從每株果樹上摘取葉片若干，置于冰壺中低溫保存，便于實驗后期進行 RT-PCR檢測分析。利用ACLSV、ASPV和ASGV外殼蛋白基因序列設計引物，進行總RNA的逆 轉錄（RT)和聚合酶鏈式反應（PCR)，由上述RT-PCR檢測結果檢驗siRNA對ACLSV、ASPV和 ASGV的防治效果。
[0024] 實施例1
[0025] 1、噴灑果樹
[0026] 實驗時間：2009年6月16日晴，傍晚五點；
[0027] 實驗地點：大連市金州區某12年生蘋果樹園和某15年生梨樹園；
[0028] 每個蘋果品種和梨品種各選5株樹，在實驗處理前，每株樹摘取葉片若干，置于冰 壺中低溫保存，用于進行RT-PCR檢測分析。根據ACLSV、ASPV和ASGV外殼蛋白基因的部分 保守序列設計ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA;
[0029]所述的 ACLSV 的 siRNA 序列為：5' -UUGGAGUUCAAUAAGGGUCUG-3' ；
[0030] ASGV 的 siRNA 序列為：5' -AACCUGGGUCGCGGUCUUGGAC-3' ；
[0031] ASPV 的 siRNA 序列為：5' -ACUGAGCGGUGUACGUUGAGGCA-3' ；
[0032] 將ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA按照質量配比1:1: 1，配制成濃度0.1ymol/L的 雙蒸水混合溶液；向ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA雙蒸水混合溶液中加入體積百分數分別 為1%、3%、5%、7%和10%的展著劑吐溫-80,將配好的溶液分別噴于每株樹的葉片表面 上，溶液噴布細致、周到。
[0033] 2、病毒檢測
[0034] 分別于2010年7月10日、2012年7月16日和2014年7月25日在實驗植株上 取葉片若干，置于冰壺中低溫保存，帶回實驗室用于RT-PCR檢測分析。對每株樹上噴前和 噴后采摘的葉片分別稱取100~200mg，重復3次稱量，采用已經建立的RT-PCR檢測體系 進行ACLSV、ASPV和ASGV的檢測。檢測結果表明：噴布0? 1 y mol/LACLSV、ASPV和ASGV的 siRNA混合溶液之前的樹體中均攜帶ACLSV、ASPV和ASGV病毒，而噴灑后于不同時間取樣 檢測的結果均表明所有實驗植株樹體中已經不攜帶ACLSV、ASPV和ASGV病毒。
[0035] 實施例2
[0036] 1、噴灑果樹
[0037] 實驗時間：2009年7月20日晴，傍晚五點；
[0038] 實驗地點：大連市金州區某12年生蘋果樹園和某15年生梨樹園；
[0039] 每個蘋果品種和梨品種各選5株樹，在實驗處理前，每株樹摘取葉片若干，置于冰 壺中低溫保存，用于進行RT-PCR檢測分析。根據ACLSV、ASPV和ASGV外殼蛋白基因的部分 保守序列設計ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA;
[0040]所述的 ACLSV 的 siRNA 序列為：5' -UUGGAGUUCAAUAAGGGUCUG-3' ；
[0041] ASGV 的 siRNA 序列為：5' -AACCUGGGUCGCGGUCUUGGAC-3' ；
[0042] ASPV 的 siRNA 序列為：5' -ACUGAGCGGUGUACGUUGAGGCA-3,；
[0043] 將ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA按照質量配比1:1: 1，配制成濃度0.3ymol/L的 雙蒸水混合溶液；向ACLSV、ASPV和ASGV的siRNA雙蒸水混合溶液中加入體積百分數分別 為1%、3%、5%、7%和10%的展著劑吐溫-80,將配好的溶液分別噴于每株樹的葉片表面 上，溶液噴布細致、周到。
[0044] 2、病毒檢測
[0045]分別于2010年7月10日、2012年7月16日和2014年7月25日在實驗植株上取 葉片若干，置于冰壺中低溫保存，帶回實驗室供進行RT-PCR檢測分析之用。對每株樹上噴 前和噴后采摘的葉片分別稱取100~200mg，重復3次稱量，采用已經建立的RT-PCR檢測體 系進行ACLSV、ASPV和ASGV的檢測。檢測結果表明：噴布0. 3 y mol/LACLSV、ASPV和ASGV 的siRNA混合溶液之前的樹體中均攜帶ACLSV、ASPV和ASGV病毒，而噴灑后于不同時間取 樣檢測的結果均表明所有實驗植株樹體中已經不攜帶ACLSV、ASPV和ASGV病毒。
[0046] 實施例3
[0047] 1、噴灑果樹
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