靶向hsv-1病毒ul18基因的小干擾rna及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物技術領域，特別涉及靶向HSV-1病毒UL18基因的小干擾RNA 分子（siRNA)及應用。
【背景技術】
[0002] 單純皰疼病毒（Herpessimplexvirus，HSV)屬于皰疼病毒科、a皰疼病毒亞科， 是一種以人類為唯一自然宿主的雙鏈包膜DNA病毒，血清學分為HSV-1和HSV-2型。HSV-1 在形成局部的皰瘆病損后，常常以各種方式進一步引起機體神經系統的感染。尤其重要 的是在感染神經系統的過程中，皰瘆病毒能夠發揮其生存技巧中最令人叫絕的方式潛 伏-再激活-這個在進化中形成的生物學優勢，使得HSV-1能夠在很大程度上避開宿主免 疫系統的攻擊，從而在機體內長期甚至終生停留。HSV-1感染性疾病常反復發作，迀延難愈， 給病人造成極大痛苦。目前，藥物治療是治療HSV感染的主要手段。臨床常用的治療藥物 主要是無環鳥苷等核苷類及其類似物，如阿昔洛韋（AcyclovihACV)、伐昔洛韋等。其作用 靶點是病毒DNA聚合酶，抑制病毒的復制。肝素可與病毒膜表面糖蛋白結合；化合物SCH 43478及其類似物抑制HSV的立即早期基因的表達；硫脲抑制劑WAY-150138可抑制UL6參 與衣殼組裝，抑制子代病毒DNA包裝進入衣殼結構。但部分核苷類似物如碘脫氧尿苷、更昔 洛韋等具有誘變性，安全性低，并且在上世紀80年代ACV耐藥株即已出現，而且隨著抗皰瘆 病毒藥物的廣泛使用，關于耐藥株的報道也越來越多。所以，尋找新的抗皰瘆病毒的治療方 法和治療靶點成為科研工作者的研發目標。
[0003] RNA 干擾（RNA interference，RNAi)是雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA) 介導的特異性基因表達沉默現象。在細胞內，dsRNA被核糖核酸酶（又稱Dicer)剪切成短 的dsRNA (21~25nt)，這種小的dsRNA被稱作siRNA。siRNA中的反義鏈與多種核酸酶形 成復合體稱作RISC復合體。隨后RISC復合體被激活成為活性狀態（RISC*)。siRNA的正 義鏈引導RISC*到沉默靶點，RISC*與沉默靶點mRNA結合，在ATP的存在下，mRNA與siRNA 的反義鏈結合互補，引發核酸酶將mRNA剪切成為21~23nt的小片段，繼而阻止mRNA的表 達翻譯，導致目的基因的沉默。已有研宄表明siRNA作為高效特異的抗病毒藥物具有極大 的發展前景，siRNA在HIV-1，SARS病毒，呼吸道綜合癥病毒等多種病毒的治療研宄中被成 功應用。
【發明內容】
[0004] 為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供靶向HSV-1病毒 UL18基因的小干擾RNA分子（siRNA)及其修飾物。解決了現有HSV-1感染治療方案中存在 的藥物毒性大、易產生耐藥性，易復發等缺陷和問題，制得靶向明確，安全可靠，效果明顯的 抗HSV-1病毒感染的新型藥品。
[0005] 本發明的另一目的在于提供靶向HSV-1病毒UL18基因的SiRNA的應用。
[0006] 本發明的目的通過下述技術方案實現：祀向HSV-1病毒UL18基因的siRNA，所述 的siRNA為siRNA181、siRNA182或siRNA183中的一種或至少兩種：
[0007] siRNA181 :正義鏈：5,-CUCAACGUGCUGUACUACAAC-3' ；
[0008] 反義鏈：5'-UGUAGUACAGCACGUUGAGGU-3' ；
[0009] siRNA182 :正義鏈：5,-CCACCAUCAUCCUUACGCUAA-3' ；
[0010] 反義鏈：5'-AGCGUAAGGAUGAUGGUGGUU-3' ；
[0011] siRNA183 :正義鏈：5'-CCCGUUAUACGCUAUCCCUAA-3' ；
[0012] 反義鏈：5'-AGGGAUAGCGUAUAACGGGGG-3' ；
[0013] siRNA N. C :正義鏈：5' -UUCUCCGAAC⑶⑶CACGUTT-3' ；
[0014] 反義鏈：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAIT-3' ；
[0015] 其中，siRNA N. C為siRNA陰性對照，其3'端的TT堿基是懸垂序列，是為了增加 siRNA在細胞內的穩定性。
[0016] 本發明中的針對HSV-1病毒UL18基因的siRNA分子，可根據實際需要進行修飾主 要由以下的修飾方式：（1)末端修飾方式（一般在正義鏈5'端修飾）：焚光基團修飾：FAM， CY3等，修飾目的是便于觀察；特殊基團修飾：生物素、氨基、膽固醇、磷酸基、S-S修飾等，其 中膽固醇修飾目的是便于進入細胞，其他修飾目的是利用末端基團進行其他實驗。（2)堿基 修飾方式：2'甲氧修飾、2'氟代修飾、硫代修飾等，修飾目的是增加穩定性。
[0017] 所述的siRNA以及衍生的修飾物可用于制備預防或治療HSV-1及與HSV-1病毒 感染相關的任何疾病的藥物或制劑。最主要的用途包括：制成滴眼液，可用于預防和治療 HSV-1感染引起的眼疾；作為涂抹劑，可用于預防和治療HSV-1感染引起的口唇皰瘆、生殖 器皰瘆；作為注射針劑，可預防和治療HSV-1潛伏感染及復發等。
[0018] 本發明相對于現有技術，具有如下的優點及效果：
[0019] (1)本發明克服現有治療HSV-1感染的藥物毒性大、易產生耐藥性，易復發等缺 陷和問題，并通過一定的科技手段制得針對UL18基因的抗HSV-1所有小干擾RNA分子 (siRNA)產品及其修飾物。
[0020] (2)本發明提供的治療或預防HSV-1病毒感染的小干擾RNA分子（SiRNA)，靶向明 確，效果明顯；
[0021] (3)本發明所提供的通過siRNA治療或預防HSV-1病毒感染的新方法是皰瘆病毒 防治的一種新思路。
【附圖說明】
[0022] 圖1是不同濃度siRNA與lipofectamineRNAiMAX的細胞毒性結果圖。
[0023] 圖2是實施例4中總RNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果圖。
[0024] 圖3是Real time PCR熔解曲線的結果圖；其中，圖3A為內參引物GAPDH和UL18 基因檢測引物的熔解曲線；圖3B為內參引物GAPDH和UL18基因檢測引物的熔解峰。
[0025] 圖4是Real-time PCR檢測siRNA干擾對UL18基因mRNA的抑制作用的結果圖。
[0026] 圖5是流式細胞儀檢測UL18-EGFP融合蛋白熒光相對表達強度的結果圖。
[0027] 圖6是siRNA干擾UL18基因對HSV-1空斑形成的影響的結果圖；其中，圖6A是不 同實驗組形成的空斑；圖6B是三種siRNA干擾后各實驗組的空斑形成量。
[0028] 圖7是siRNA干擾UL18基因對HSV-1感染細胞后胞內病毒粒子數量的影響的結 果圖；其中，圖7A是HSV-1感染對照組；圖7B是陰性對照siN. C對照組；圖7C是siRNA182 干擾組。
【具體實施方式】
[0029] 下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限 于此。
[0030] 下列實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規實驗條件或按照制 造廠商所建議的實驗條件。
[0031] 實施例1
[0032] 本發明針對HSV-1病毒UL18基因核苷酸序列，設計siRNA雙鏈序列，封閉和抑制 HSV-1UL18基因的表達，導致HSV-1的核衣殼無法正常組裝，從而最終抑制HSV-1增殖和感 染，以解決現有HSV-1感染治療方案中存在的藥物毒性大、易產生耐藥性，易復發等缺陷和 問題；本發明所提供的siRNA雙鏈序列可用于制備預防或治療HSV-1及與HSV-1病毒感染 相關的任何疾病的藥物或制劑。該siRNA雙鏈序列通過某種方式進入到生物體內時，可以 高效、特異的抑制HSV-1疾病相關衣殼蛋白的表達，使有關基因發生沉默，從而對靶基因的 表達進行有效敲除，達到治療和預防HSV-1及與HSV-1病毒感染相關的疾病的目的。本發 明靶向明確，效果顯著。
[0033] 本發明根據HSV-1UL18基因序列（Genebank登錄號：AB618031. 1)，將UL18基因 的編碼區序列提交 siRNA 在線設計網站 http://jura. wi. mit. edu/bioc/siRNA ;https:// www.genscript.com/ssl-bin/app/rnai ；http://www.ambion.com/techlib/misc/ siRNA-f inder. html，根據siRNA設計原則初步設計和篩選潛在的siRNA。將UL18基因序列 提交http://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST網站，分析基因序列的保守性，選取不同毒株 及種屬間的共同保