亞群的制備及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及骨相關間充質干細胞，具體涉及骨相關間充質干細胞Scal+亞群的制備及應用。
【背景技術】
[0002]骨龕的組成復雜多樣，包含了多種細胞成分、細胞外基質成分、氧氣張力生長因子、細胞因子，以及維持微環境的PH、離子強度、代謝物等物理化學因素。骨相關間充質干細胞(bone-associated MSC)是骨龕的組分細胞之一，其具有多種分化潛能，在不同的誘導條件下，骨相關間充質干細胞可以發育為骨細胞、神經細胞、脂肪細胞、肌肉細胞等。
【發明內容】
[0003]本發明提供的骨相關間充質干細胞Scal+亞群的制備方法包括:利用抗-⑶45抗體、抗_Terll9抗體和抗-Scal抗體對骨相關間充質干細胞進行分選得到骨相關間充質干細胞Scal+亞群。
[0004]本發明同時還提供了骨相關間充質干細胞Scal+亞群用于治療腫瘤相關性貧血的應用。
[0005]本發明還提供了骨相關間充質干細胞Scal+亞群制備緩解急性移植物抗宿主病的應用。
【附圖說明】
[0006]圖1為流式細胞儀鑒定骨相關間充質干細胞Scal+亞群分選純化的結果。
[0007]圖2為分選的骨相關間充質干細胞Scal+亞群，⑶271 +亞群和SSEA4-1 +亞群體外培養5d后檢測細胞增殖結果，顯微鏡放大倍率為400 X。
[0008]圖3為骨相關間充質干細胞Scal+亞群支持造血重建結果；圖A為技術路線示意圖；圖B為克隆形成分析結果；圖C為骨髓移植后1-4月HSC重建形成分析，a圖為HSC重建分析；b圖為T細胞重建分析；c圖為髓系細胞重建分析；d圖為B細胞重建分析。
[0009]圖4為野生型小鼠(Ctrl)、未治療組(B16)、混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)小鼠生存曲線比較結果。
[0010]圖5為野生型小鼠(Ctrl)、未治療組(B16)、混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)的長骨比較。
[0011]圖6為骨相關間充質干細胞Scal+亞群移植治療后，野生型(Ctrl)，未治療組(B16)，混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)小鼠外周血檢測結果比較；圖八為外周血中紅細胞計數；圖B為外周血中紅細胞壓積；圖C為外周血中血紅蛋白的濃度；圖中*代表顯著性差異程度，*P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001 ；ns代表沒有顯著差異。
[0012]圖7為骨相關間充質干細胞Scal+亞群移植治療后，野生型(Ctrl)，未治療組(B16)，混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)小鼠的骨髓中紅系細胞發育檢測，圖A為流式檢測圖，圖B為數據統計分析圖。
[0013]圖8為骨相關間充質干細胞移植治療后，同種骨髓移植組(Ctrl)，異種骨髓移植組(BM)、混合群治療組(MSC)和亞群治療組(Seal)的生存曲線比較結果。
[0014]圖9為骨相關間充質干細胞移植治療后，同種骨髓移植組(Ctrl)，異種骨髓移植組(BM)、混合群治療組(B16/MSC)和亞群治療組(B16/Scal)的臨床評分比較結果。
【具體實施方式】
[0015]造血微環境(Niche)這一概念在1978年由Schofield首先提出。這是一種從低等動物到哺乳動物都存在的造血調控模式。多項研宄證實，Niche是調控HSC生理功能的主要功能單位，是HSC的維持和調控依賴的特定細胞微環境。Niche內的多種細胞可通過產生細胞因子，或者細胞直接接觸的方式，去調控HSC的自我更新、多向分化和不對稱分裂。如Niche內Wnt信號的非經典成員Flamingo和Frizzled分子之間的相互作用，直接參與維持HSC的穩態；抑制Wnt信號同時活化mTOR信號，體內外均可有效維持HSC ；內皮細胞來源的Notch受體能促進LT-HSC的增殖；Niche來源的Hedgehog信號參與維持HSC，腺苷脫氨酶信號則可以對抗Hedgehog對HSC的調控作用。目前認為Niche主要有血管龕和骨龕兩種經典的結構。血竇內皮龕除了定位于骨髓以外，還存在于肝臟、脾臟等具有血竇結構的器官內；骨龕僅位于骨髓。骨龕通過其構成細胞產生的各種造血相關細胞因子或者信號分子對HSC的增生分化、發育、成熟、迀移、定居、釋放、凋亡等活動產生直接影響作用，從而實現對HSC生物學行為的調控。
[0016]作為Niche的重要組成部分，骨相關MSC不僅對HSC生理功能的調控過程起到了重要作用，而且對各系細胞，尤其是免疫細胞，如T細胞、樹突細胞、DC細胞等的分化發育都起到了調節作用。但是骨相關MSC是多種類型細胞組成的混合群細胞，其功能與MSC的來源、分離純化技術、分選標記都有密切關系。
[0017]腫瘤相關性貧血(cancer related anemia, CRA)是惡性腫瘤常見的并發癥之一，能顯著影響臨床治療效果和腫瘤患者生存期。CRA發生的本質是實體腫瘤發生時，紅系細胞發育分化的過程異常，導致患者外周血中單位容積內紅細胞計數、血紅蛋白濃度或紅細胞壓積異常，即臨床癥狀為貧血。目前臨床上CRA的治療方案主要是采用對癥治療、輸血治療、重組EPO以及鐵劑補充等方法。這些治療方法能暫時改善患者貧血的臨床癥狀，但是并不能完全從根本上治療CRA。同時這些治療方法本身還存在一定局限性與副作用。因此如果能夠從根本上，即從影響紅系細胞的生成發育過程的因素對CRA進行治療，可能會大大提高CRA的治療效果。造血微環境是調控紅系生成發育的重要因素之一，而骨相關MSC作為其重要組成部分，也參與了紅系生成發育得調控。因此以其作為CRA治療的靶向目標，不僅能從根本上對CRA起到治療作用，同時還會減低CRA的復發率，最終提高腫瘤患者的生存治療。
[0018]造血干細胞移植是治療血液惡性疾病的有效途徑，然而并發癥移植物抗宿主病(graft versus host disease, GVHD)的發生成為阻礙造血干細胞移植成功的主要原因。接受異體移植物的受體發生急性移植物抗宿主病(acute graft versus hostdisease, aGVHD)的概率是50%，其中不到20%的人移植后能存活超過5年，尤其是抗固醇類aGVHD能導致90 %的致死率。目前，臨床上采用多種細胞治療方法預防或治療GVHD，其中包括不同來源的MSCs。但是目前誘導移植免疫耐受時多使用MSCs混合群，而MSCs亞群眾多，功能差異較大，為了使MSCs在臨床上得到更好的應用，需要探索MSCs各細胞亞群在免疫耐受誘導中的作用以及機制。
[0019]發明人意外地發現，將從小鼠脛骨、股骨上得到的骨相關MSC利用發明人獨創的分選標記對其進行分選鑒定，獲得了較高純度的Scal+亞群細胞。
[0020]發明人意外的發現，上述獲得的Scal+亞群細胞可以在體外培養并增殖；并且參與支持造血重建。
[0021]發明人利用分選得到的Scal+亞群細胞對CRA模型小鼠進行治療，發現治療后的模型小鼠外周血貧血癥狀被糾正，同時改善了骨髓中紅系前體細胞發育異常的情況；且治療效果比混合群細胞明顯。
[0022]發明人利用分選得到Scal+亞群細胞對aGVHD小鼠模型進行治療，發現治療后的模型小鼠aGVHD臨床癥狀有所改善，生存時間延長；且治療效果比混合群細胞明顯。
[0023]實施例1.骨相關間充質干細胞制備
[0024]1、取小鼠股骨和腔骨，去除所有肌肉組織，PBS沖洗骨頭后，放于研磨杯內研磨至骨髓釋放，分離收集骨髓待用。加入PBS沖洗骨頭，再次研磨和沖洗，直到骨頭全部變成白色;
[0025]2、用吸水紙吸干殘余PBS，加入0.5 %膠原酶(3mg/mL, Sigma, Ronkonkoma, NY, USA)混勾后，搖床上 37°C消化 Ih ；
[0026]3、取60 μ m孔徑濾網，過濾消化后骨混合物，收集慮過液，1500rpm離心5min后棄上清;
[0027]4、向上述細胞沉積中加入適量紅細胞裂解液，室溫靜止2min，加入過量的PBS后，1500rpm離心5min，棄上清，獲得細胞沉積即為骨相關間充質干細胞。
[0028]實施例2.骨相關間充質干細胞亞群細胞制備
[0029]1、骨相關間充質干細胞Scal+亞群的制備
[0030]1.1將得到骨相關MSC細胞轉入5mL試管中并計數，然后按照磁珠分選試劑盒(easysep mouse select1n kit, Stem Cell Ltd.Vancouver, Canada)要求加入適量的分選緩沖液以及標記緩沖液、磁珠。按照磁珠分選試劑盒操作要求進行細胞分選。
[0031]1.2將分選得到的細胞計數，取適量細胞轉入流式管中，1500rpm離心5min后棄上清。
[0032]1.3 在 20 μ I 流式緩沖液中加入抗-CD45(30-F11, B1legend, California, USA)，抗-Terll9(17-5921，eB1science, San Diego, USA)，抗-Seal (E13-161.7, B1legend, California, USA)流式抗體，混勾。
[0033]1.4將上述預混的流式抗體加入到所得的細胞沉積中，2-8°C染色20min，流式緩沖液重懸后1500rpm離心5min，細胞重懸于300 μ I流式緩沖液，流式儀上機分選骨相關間充質干細胞Scal+亞群，結果如圖1所示。
[0034]2、骨相關間充質干細胞⑶271+亞群細胞的制備
[0035]2.1將得到骨相關MSC細胞轉入5mL試管中并計數，然后按照磁珠分選試劑盒要求加入適量的分選緩沖液以及標記緩沖液、磁珠。按照磁珠分選試劑盒操作要求進行細胞分選。
[0036]2.2將分選得到的細胞計數，取適量細胞轉入流式管中，1500rpm離心5min后棄上清。
[0037]2.3在20 μ I流式緩沖液中加入抗-⑶45，抗-Terl 19，抗-⑶271流式抗體，混勻。
[0038]2.4將上述預混的流式抗體加入到所得的細胞沉積中，2-8°C染色20min，流式緩沖液重懸后1500rpm離心5min，細胞重懸于300 μ I流式緩沖液，流式儀上機分選⑶271+亞群細胞。
[0039]3、骨相關間充質干細胞SSEA4+亞群細胞的制備
[0040]3.1將得到骨相關MSC細胞轉入5mL試管中并計數，然后按照磁珠分選試劑盒要求加入適量的分選緩沖液以及標記緩沖液、磁珠。按照磁珠分選試劑盒操作要求進行細胞分選。
[0041]3.2將分選得到的細胞計數，取適量細胞轉入流式管中，1500rpm離心5min后棄上清。
[0042]3.3在20 μ I流式緩沖液中加入抗-CD45，抗-Terl 19，抗-SSEA4流式抗體，混勻。
[0043]3.4將