一種海豚鏈球菌環介導等溫擴增試劑盒及其應用
【技術領域】
[0002] 本發明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種快速、可視化并且可實時定 量檢測海豚鏈球菌的環介導等溫擴增試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0003] 魚類鏈球菌病是一種由鏈球菌感染引起的疾病，病原菌歸屬3個屬和7個種。 鏈球菌屬的病原菌有海豚鏈球菌（Streptococcusiniae)、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactme)、副乳房炎鏈球菌（Streptococcusparauberis)及停乳鏈球菌（Streptococcus dysgalactiae);乳球菌屬的有格氏乳球菌（Lactococcusgarvieae)和魚乳球菌 (Lactococcuspiscium);漫游菌屬的有鮭魚漫游菌（Vagococcussalmoninarum)。其中， 海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、副乳房炎鏈球菌、停乳鏈球菌及格氏乳球菌為暖水魚類鏈球菌病 的病原菌，而魚乳球菌和鮭魚漫游菌屬于冷水性魚類鏈球菌病的病原菌。
[0004]目前發現海豚鏈球菌和無乳鏈球菌是引起多種野生魚類和經濟養殖魚類鏈球菌 病的最主要兩種病原。其中，由海豚鏈球菌引起的鏈球菌病在全世界范圍內可引發多種淡 水和海水魚類大面積感染，具有很高感染率和致死率。該菌可感染包括虹鱒魚、海鯉、羅非 魚、黃獅魚、鯰魚、白花魚、鯡魚、鯔魚等在內的17種魚類。
[0005] 鏈球菌病呈全球流行，每年給世界羅非魚產業造成巨額經濟損失。在中國，2001~ 2006年羅非魚養殖陸續出現鏈球菌病，并在個別養殖場造成5~15%的累計死亡率。 2009~2012連續4年，該病在中國羅非魚主要養殖區大面積暴發流行，累計死亡率在15~ 95%之間，給我國羅非魚養殖業造成的經濟損失累計高達16億美元。如何快捷、高效、準確 地診斷海豚鏈球菌病就顯得格外重要。
[0006]目前，魚類海豚鏈球菌的檢測技術主要有常規方法和分子生物學方法。常規方法 是通過對細菌的表型特征和生化指標進行鑒定。鑒定海豚鏈球菌的生化指標主要包括：革 蘭氏染色、氧化酶實驗、過氧化氧酶實驗、CAMP實驗、V-P反應（福格斯-普利斯考爾）產物 實驗、凝集實驗、ELISA實驗；Lancefield氏群特異性抗原群鑒定等。但常規鑒定方法存在 操作復雜，所需時間長以及特異性不強的缺點。目前有一些自動快速細菌鑒定系統用于鏈 球菌鑒定，如RAPIDStrepstrip、APIrapidstrep32、API20EVitek系統、ATB快速檢 測系統等，但細菌自動鑒定儀器檢測海豚鏈球菌的結果不穩定，且由于細菌自動化鑒定的 數據庫中模式菌株數量有限，鏈球菌的關鍵數據尚在研究中，因此該方法的應用也受到限 制。
[0007] 利用基因組16SrRNA基因開發的特異性聚合酶鏈式反應（PCR)方法常用于鑒定鏈 球菌。此外，還有利用16S-23SrDNA序列、乳酸氧化酶（lctO)和CAMP因子等對鏈球菌進 行快速PCR鑒定。另外，也建立了海豚鏈球菌的雙重PCR方法和巢式PCR方法用于檢測海 豚鏈球菌。雖然PCR方法較常規方法快速準確，但需要復雜的儀器設備，成本較高，不適合 基層和現場檢測。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是提供一種為基層簡便、快捷準確地檢測魚類海豚鏈球菌的方法， 公開一種快速、可視化并可實時定量的檢測海豚鏈球菌的環介導等溫擴增試劑盒。為實現 本發明目的所提供的技術方案為：一種海豚鏈球菌環介導等溫擴增試劑盒，該試劑盒包括 LAMP引物、2X反應緩沖液、BstDNA聚合酶、熒光目視檢測試劑、超純水和海豚鏈球菌DNA 模板，所述的LAMP引物包括外引物F3(SEQIDN0:1)與B3(SEQIDN0:2)和內引物FIP (SEQIDNO:3)與BIP(SEQIDNO:4); 其中引物的序列分別為： F3AAGCAGATTTGGAACAAGC B3TTTAAGAGCAGGTTTTTCTTCT FIPTCTGCCAATTGTTTTTGAAGTTCAGTGCACGAGAATTAGATACGC BIPAACACAGAATTAACAGCAACTGTTGGCTTCTTTCTTAGCCGCT； 所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL、KCL、MgS04、（NH4)2S04、Tween20、Betaine和dNTPs〇
[0009] 所述的海豚鏈球菌DNA模板提取自海豚鏈球菌培養物，使用細菌基因組DNA提取 試劑盒提取。
[0010] 所述的熒光目視檢測試劑采用鈣黃綠素熒光試劑，熒光試劑在反應前加入。
[0011]所述的 2X反應緩沖液包括Tris-HCL30-60mM、KCL25-40mM、MgS04 15-25mM、 (NH4)2S04 2 5-30mM、Tween20 0.3-0.7%、Betaine1.5-3.5M和dNTPs3-5mM，其配制方法 在pH為8. 8條件下，將上述溶劑混合均勻獲得。
[0012] 一種海豚鏈球菌環介導等溫擴增試劑盒的應用，用于檢測疑似海豚鏈球菌，具體 檢測步驟包括： (1) LAMP引物的設計與合成 (2) 海豚鏈球菌DNA模板的提取 (3) LAMP反應體系建立 (4) LAMP檢測方法。
[0013] 所述LAMP反應體系建立以25iiL計， 2X反應緩沖液 12. 5yL BstDNA聚合酶 1iiL FIP 40 pmol BIP 40 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 海豚鏈球菌DNA 2uL 超純水 補足25iiL。
[0014] 所述的LAMP檢測方法檢測樣品溶液為提取的海豚鏈球菌、對照細菌以及臨床分 離菌的基因組DNA。
[0015] 所述的LAMP檢測方法采用LoopampLA-320C實時濁度儀進行密閉全程監控，反應 溫度為63°C、反應在20-30分鐘間出現擴增。
[0016] 本發明的實質性特點和顯著進步是： 1)特異性強 本發明的環介導等溫擴增試劑盒特異性檢測出海豚鏈球菌，所檢測的陰性對照病毒、 陰性對照細菌和水對照均無陽性結果出來，與PCR檢測結果一致。
[0017] 2)靈敏度高 普通的PCR檢測方法的靈敏度為1. 7X1(T6ng/yL，而使用本發明檢測方法，檢測限約 為1.7父10_81^/111，比普通？0?的靈敏度提高了將近100倍。
[0018] 3)迅速得出結果 普通的PCR整個過程在24小時左右才能得出結果，目前多數建立的LAMP反應方法在 反應結束后，須采用瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像來判定結果，從細菌DNA提取到獲取 試驗結果，需要5-6小時左右。本發明提供的LAMP檢測方法反應在20-30分鐘間出現擴 增，60分鐘內即可完成擴增，且結果判讀方式簡便，在可見光下將陽、陰性管進行比較，通過 肉眼可明顯看到陽性反應呈明顯渾濁，陰性反應管透明；短暫離心后，陽性反應管底部有明 顯的白色焦磷酸鎂沉淀物，而陰性反應管底部無沉淀物；或加入熒光染料，陽性反應管在紫 外光下呈綠色，用肉眼便可觀察實驗結果。不需要再進行瓊脂糖凝膠電泳紫外線分析顯像 或者開蓋加入熒光染料進行來判讀結果，從細菌DNA提取到獲得最終結果可在2-3小時內 完成。
[0019] 4)不造成污染 目前雖然已經建立有LAMP顯色法用于檢測海豚鏈球菌，但顯色法只能是反應結束后 開蓋加入熒光染料進行顯色反應，觀察是否有顯色來判讀試驗結果，開蓋容易造成實驗室 污染。而本發明的LAMP熒光目視檢測方法，熒光染料是在反應前加入，避免開蓋造成污染， 此外，本發明的LAMP檢測方法在結果判定上，可以直接通過濁度儀檢測反應管的濁度值來 判定結果，可不進行熒光染料法檢測結果或者進行瓊脂糖凝膠電泳檢測結果，不需要開蓋， 能有效避免污染。
[0020] 5)可實時定量 本發明利用Tubidimeterreal-timeLA-320池度儀來實時分析LAMP反應的結果，不 同的標準樣品的濃度對應的濁度值的時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求 出各時間的海豚鏈球菌拷貝數，達到定量檢測產物的目的。
【附圖說明】
[0021] 圖1是本方明LAMP方法特異性檢測結果；其中1、海豚鏈球菌；2、大腸桿菌；3、嗜 水氣單胞菌；4、維氏氣單胞菌；5、鮰愛德華氏單胞菌；6、哈氏孤菌；7、創傷孤菌；8、無乳鏈 球菌；9、陰溝腸桿菌；10、水對照。結果顯示1株魚海豚鏈球菌反應管出現濁度的上升曲線， 8株陰性對照菌反應管和水對照反應均無擴增。
[0022] 圖2和圖3是本發明LAMP檢測方法及傳統PCR方法的敏感性檢測結果；其 中A: 1. 7X102ng/iiL;B: :1. 7X101ng/iiL;C: 1. 7X10。ng/iiL;D: 1. 7X1CT1ng/iiL; E: 1. 7X1(T2ng/iiL;F:1. 7Xl(T3ng/iiL;G: 1. 7X1(T4ng/iiL;H: 1. 7X1(T5ng/iiL; 1:1. 7X1CT6ng/iiL;J: 1. 7X1CT7ng/iiL;K: 1. 7X1CT8ng/iiL;L:water。重組質粒pMD18-T-&i的起始濃度為1. 7X10 2ng/iiL，經10倍倍比稀釋后進行LAMP和PCR擴增，結 果顯示LAMP法檢測限約為1. 7X10_8ng/iiL，而PCR法檢測限為1. 7X10_6ng/iiL。
[0023] 圖4是加入熒光染料檢測結果：右管為以海豚鏈球菌基因組DNA為模板的反應情 況，為陽性結果，左管為陰性對照的反應情況，為陰性對照結果。
[0024] 圖5是本發明定量檢測海豚鏈球菌LAMP方法的標準曲線；利用不同的標準樣品的 濃度對應的濁度值對時間繪制成的標準曲線，代入標準曲線方程，即可求出各時間的海豚