一種雞伴性橫斑羽基因的鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于動物遺傳育種領域，涉及一種雞伴性橫斑羽基因的鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 雞的羽色豐富多彩，是雞品種特征的重要組成部分，也是雞育種工作中一項重要 的內容。雞的蘆花羽也叫橫斑羽，是一種黑白或深淺條紋相間的羽色，包括性連鎖橫斑羽和 常染色體橫斑羽兩種類型。伴性橫斑羽由于其性狀規則，特點明顯，伴性遺傳，其獲得了更 多的關注和研宄。伴性橫斑羽的雌雄自別已經成熟地應用到了育種工作和現代商品雞的生 產中。
[0003] 伴性橫斑羽由Z染色體上單基因B控制，屬于不完全顯性遺傳，具有劑量效應，成 年的蘆花羽毛色素沉著表型為羽毛黑白條紋相間，B基因純合子公雞（ZBZB)的白色橫紋寬 度大于雜合子個體（ZBZb)及半合子母雞（ZBW)。剛孵化的雛雞為黑色絨毛，頭上有白色斑 點，純合子公雞（ZBZB)頭頂上的斑點要比母雛（ZBW)的斑點大。隱性純合子個體（ZbZb或 ZbW)無典型的橫斑羽表型。該基因除了對羽毛顏色有影響外，還對脛色有稀釋作用。
[0004] 橫斑羽作為一種性狀，在很多家禽品種中都或多或少的有所表現。但作為研宄橫 斑羽表型的代表性品種，應當是以此作為品種特征的雞種，非常突出的品種就是蘆花雞。國 外主要以普利茅斯橫斑洛克雞（BarredPlymouthRock，BPR)為研宄橫斑羽表型的品種。 我國主要的橫斑羽家雞品種是山東汶上蘆花雞。
[0005] 在20世紀20年代到30年代間，研宄者開始嘗試解釋伴性橫斑羽的機制。 Danforth和Foster(1929)認為這種模式可能由代謝或激素分泌的節律性差異引起的。他 們在一日齡的橫斑和非橫斑羽雞之間進行了皮膚移植實驗，發現長出的羽毛在結構上像受 體雞，在羽毛顏色和橫斑模式上像供體雞。Montalenti(1934)觀察到兩個毗鄰的橫斑羽毛 并不一定同時出現白色和黑色條帶。這兩項研宄共同表明引起橫斑羽的基因表達產物必須 作用在羽毛囊。Nickerson(1944)、Bowers和Asano(1984)報道了在白色條帶形成時，普利 茅斯橫斑洛克雞（BPR)羽毛囊中的未成熟黑色素細胞死亡現象，這些作者都認為細胞死亡 是橫斑羽白色條帶的形成原因。后來，B〇wers(1988)提出白色條帶的形成是由于羽毛囊中 黑色條帶的鄰近邊緣的黑色素細胞的自噬小體退化。Bowers(1994)等報道了來自BPR的黑 色素細胞對氧化應激比來自野生型雞種的更加敏感。
[0006] Punnet(1940)發現B基因與真皮黑色素抑制基因（Id)連鎖，研宄結果證明這2個 位點在遺傳連鎖圖上只有10個圖距單位。Cock(1964)發現性連鎖橫斑羽基因由單基因B 控制，性連鎖橫斑羽屬于不完全顯性遺傳，具有劑量效應，B基因純合個體白色橫紋寬度大 于雜合子個體及半合子個體。Bitgood等（1980,1988)通過連鎖作圖把B等位基因定位在 Z染色體的長臂末端，與Id基因、隱性白膚色基因（y)及Z染色體易位斷裂點（Tb)位點相 距不遠，排列順序由端區向著絲點依次為B-Id-Tb-y，結果表明遺傳距離與是否存在易位有 關。Dorshorst等（2009)進一步定位研宄，結果發現B基因位于Z染色體長臂末端355kb 處。HellstrOm等（2010)應用測序技術及基因組精細作圖技術，將B基因定位到⑶KN2A/B 位點，提出在⑶KN2A基因中與伴性橫斑完全相關的12Kb的單倍型，包含INK4b及部分ARF轉錄本，這段單倍型里發現了 2個非編碼SNPs，分別在⑶NK2A的啟動子區域（SNP1:A-G 突變）和內含子1 (SNP2:C-A突變）內。此外還發現了 2個錯義突變，其在ARF的轉錄序 列里，B1(V9D)和B2(R10C)。這4個位點的突變是哪一個或者哪種組合導致的橫斑表型還 不確定。HellstrOm提出的模型認為：兩個錯義突變是需要的，但可能并不充分引起伴性橫 斑羽表型。
[0007]細胞周期依賴性激酶抑制基因（cyclin-dependentkinaseinhibitor，CDKN2A)， 是一種重要的抑癌基因，屬于細胞周期依賴性激酶抑制因子基因家族，具有調節細胞增殖 與凋亡的作用。CDKN2A基因又稱INK4a-ARF基因，其編碼pl6INK4a和pl4ARF蛋白分別通 過RB和p53蛋白發揮作用。⑶KN2A基因在諸多腫瘤中的改變，使它在腫瘤發生中的作用日 益受到重視。Quelle(1995)等報道CDKN2A/B基因位點在腫瘤抑制和細胞增殖擴散過程中 以ARF和INK蛋白調節細胞周期。INK4抑制細胞周期蛋白依賴性激酶D，引起在G1期的細 胞周期停滯。在人類和小鼠中，ARF-p53-MDM2網絡均可以調節細胞周期和G1期到S期的 轉變或者直接導致細胞凋亡。Kim(2003)等報道了INK4a轉錄本在雞中的缺失，并猜想由其 他基因來彌補腫瘤抑制功能。通過雞INK4b和人Cdk4和Cdk6的共沉淀轉染實驗，表明了 雞INK4b表現出和典型的INK4b蛋白同樣的功能。雞INK4b還可以引起細胞增殖的大量抑 制。
[0008] 如上所述，伴性橫斑羽基因被定位到⑶KN2A/B位點，但是其原因突變還沒有確 定。
【發明內容】
[0009] 本發明的一個目的是提供一種鑒定雞伴性橫斑羽基因基因型的引物對。
[0010] 本發明提供了鑒定雞伴性橫斑羽基因基因型的引物對，其由序列表中序列2所示 的單鏈DNA分子和序列表中序列3所示的單鏈DNA分子組成。
[0011] 本發明另一個目的是提供鑒定雞伴性橫斑羽基因基因型的試劑盒。
[0012] 本發明提供的試劑盒，包括上述的引物對和限制性內切酶；
[0013] 所述限制性內切酶為Taal(ThermoScientific公司產品，產品編號#ER1362)或 HpyCH4III〇
[0014] 上述試劑盒還包括酶切緩沖液和PCR擴增緩沖液；其具體由所述引物對、所 述限制性內切酶Taa、酶切緩沖液（與所述限制性內切酶Taal配套使用的緩沖液，ThermoScientific公司，產品編號 #BY5)和PCR擴增緩沖液（2XTaqPCRmasterMix，北京 匯天東方科技有限公司，產品編號HT201)和水組成。
[0015] 所述引物或所述酶均為單獨包裝。
[0016] 上述引物或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定雞伴性橫斑羽基因基因型中的應用也 是本發明保護的范圍。
[0017] 上述伴性橫斑羽基因基因型為BB基因型、Bb基因型或bb基因型；
[0018] 所述BB基因型為ZBZB基因型或Z BW基因型，顯性橫斑羽純合（表型橫斑羽）；
[0019] 所述Bb基因型為ZBZb基因型，顯性橫斑羽雜合（表型橫斑羽）；
[0020] 所述bb基因型為ZbZb基因型或Z bW基因型，隱性橫斑羽（表型非橫斑羽）。
[0021] 本發明的第三個目的是提供鑒定或輔助鑒定待測雞伴性橫斑羽基因基因型的方 法。
[0022] 本發明提供的方法，包括如下步驟：
[0023] 1)用上述引物對對待測雞進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；
[0024] 2)將所述PCR擴增產物用限制性內切酶酶切，得到酶切產物；
[0025] 3)檢測酶切產物，用如下（1)-(3)中任一種鑒定或輔助鑒定雞伴性橫斑羽基因基 因型：
[0026] (1)若所述酶切產物僅為大小為490_520bp的片段，則所述待測雞的伴性橫斑羽 基因基因型為或候選為BB基因型；
[0027] (2)若所述酶切產物為大小為490-520bp、430-450bp和60-70bp的片段，則所述待 測雞的伴性橫斑羽基因基因型為或候選為BB基因型；
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