快速鑒定辣椒疫霉PcORP1基因核苷酸點突變及其對氟噻唑吡乙酮抗藥性的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鑒定辣椒疫霉氧化固醇結合蛋白相關蛋白PcORPI基因核苷酸點 突變的鑒定及其在殺菌劑氟噻唑吡乙酮抗性檢測中的應用，具體公開一種快速鑒定辣椒疫 霉PcORPI基因核苷酸點突變及其對氟噻唑吡乙酮抗藥性的分子檢測方法及專用引物。屬 于分子生物學技術領域。
【背景技術】
[0002] 辣椒疫霉（PhytophthoracapsiciLeonian)是一種重要的土傳植物病原卵菌，寄 主范圍廣泛，可侵染至少27科中的71種寄主植物。辣椒疫霉侵染辣椒引起的辣椒疫病，是 一種世界性分布的毀滅性病害，在我國普遍發生，且有逐年加重趨勢。在氣候適宜的條件 下，短期內就可爆發，蔓延速度極快，一般發病可引起30%產量損失，嚴重時可導致絕產。
[0003]目前，化學防治以其速效和高效的特點，在辣椒疫霉等植物病原卵菌病害的防治 中依然發揮著不可替代的作用。但是隨著一些內吸性殺菌劑的不合理頻繁使用，許多植物 病原卵菌已經對其產生了嚴重的抗藥性。因此，國際上各大農化公司一直致力于開發具有 全新作用機制且與市場上現有殺菌劑無交互抗藥性的新型殺菌劑，用于辣椒疫霉等植物病 原卵菌病害的防治和抗藥性治理。
[0004] 氟噻挫吡乙酮（oxathiapiprolin)即是美國杜邦公司2007年研發出的具有全 新化學結構的新型植物病原卵菌抑制劑，其化學結構包括了吡唑環、噻唑環及異惡唑啉環 (W02008013925)，是迄今為止生物活性最高的一類卵菌抑制劑，也是21世紀最有代表性并 有望形成系列產品的新型殺菌劑，目前國際上殺菌劑抗藥性行動委員會（FRAC)將這類殺 菌劑命名為哌啶基噻挫異惡挫啉類化合物（piperidinylthiazoleisoxazoline，PTIs)。 杜邦公司前期通過親和色譜等研宄，發現該藥劑的作用靶標為人類氧化固醇結合蛋白同源 相關蛋白（oxysterolbindingprotein-relatedprotein，ORP) (W02013009971)，這是一 種全新的殺菌劑作用靶標。
[0005] 目前，氟噻唑吡乙酮正在我國及全球不同地區申請登記用于防治辣椒疫霉菌，致 病疫霉，黃瓜霜霉病菌及葡萄霜霉病菌等植物病原卵菌的防治，具有廣闊的應用前景。但 是，本研宄室通過藥劑馴化的方法得到了對氟噻唑吡乙酮產生高抗性水平的辣椒疫霉菌 株，并且部分抗性菌株的生存適合度較高，表明具有較高的抗性風險。因此，在使用氟噻唑 吡乙酮防治植物病原卵菌病害時需要關注并避免抗藥性的產生，加強檢測和早期預警病原 菌對氟噻唑吡乙酮的抗性發生發展情況，這有助于指導氟噻唑吡乙酮的科學使用，延緩抗 藥性的發生和發展，延長藥劑的使用年限。
[0006] 殺菌劑抗性常規檢測方法包括：菌絲生長速率法、菌絲干重測定法、孢子萌發測定 法和瓊脂展布法等。但是這些方法都需要先分離并純化病原菌，然后接種于帶藥培養基上 或接種于殺菌劑處理過的活體植株或組織上，一定時間之后才能調查結果。采用常規的方 法，當田間抗藥性菌株的頻率> 1 %時，才能被檢測到（如有95%的概率檢測到1 %頻率的 抗藥性菌株，檢測的樣本量需大于300)，因此具有靈敏度低，工作量大，試驗周期長等缺點。
[0007] 隨著分子生物學技術的飛速發展及其應用范圍的不斷擴展，限制性酶切PCR、等位 特異PCR分子技術開始在病原菌抗藥性檢測中應用。與傳統的檢測方法比較，不但節省了 檢測時間、提高了工作效率，而且提高了檢測的靈敏度，檢測頻率在1〇_ 5~10 _4,更適用于檢 測低頻率的抗藥性基因，因此也被作為田間抗藥性早期診斷的理想方法。因此，分子檢測技 術將在病害的可持續管理系統中發揮愈來愈重要的作用。
【發明內容】
[0008] 本發明的一個目的是提供兩種檢測或輔助檢測辣椒疫霉菌中PcORPl基因是否存 在突變位點的方法及其專用引物。
[0009] 本發明所提供的第一種檢測或輔助檢測辣椒疫霉菌中PcORPl基因是否存在突變 位點的方法，包括如下步驟：
[0010] 以待測辣椒疫霉菌的基因組DNA為模板，用SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引 物對進行PCR擴增，若PCR擴增產物為494bp的片段，則所述待測辣椒疫霉菌中PcORPl基 因存在或候選存在突變位點；
[0011] 所述突變位點指辣椒疫霉菌中PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位 核苷酸為G和T雜合或T純合。
[0012] 所述PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位核苷酸也就是SEQIDNO: 6中自5'末端起第2379位核苷酸。
[0013] 上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為54. 4°C。
[0014] 本發明所提供的第二種檢測或輔助檢測辣椒疫霉菌中PcORPl基因是否存在突變 位點的方法，包括如下步驟：
[0015] 以待測辣椒疫霉菌的基因組DNA為模板，用SEQ IDNO :3和SEQ IDNO :4所示引 物進行PCR擴增，再用Pf1MI酶切所得部分PcORPl基因，若酶切產物中含有789bp和472bp 片段，則所述待測辣椒疫霉菌中PcORPl基因存在或候選存在突變位點；
[0016] 所述突變位點指辣椒疫霉菌中PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位 核苷酸為G和T雜合或T純合。
[0017] 所述PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位核苷酸也就是SEQ IDNO : 6中自5'末端起第2379位核苷酸。
[0018] 上述過程中，所述PCR擴增中，退火溫度為60°C。
[0019] 本發明所提供的檢測或輔助檢測辣椒疫霉菌中PcORPl基因是否存在突變的引物 對，由SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2, SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4所示DNA分子組成。
[0020] 本發明的另一個目的是提供辣椒疫霉菌中PcORPl基因或蛋白的突變位點。
[0021] 本發明所提供的辣椒疫霉菌中PcORPl基因的一個突變位點，為辣椒疫霉菌中 PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位核苷酸為G和T雜合或T純合。其中，所 述PcORPl基因的基因組序列自5'末端起第2379位核苷酸也就是SEQIDNO:6中自5'末 端起第2379位核苷酸。
[0022] 本發明所提供的辣椒疫霉菌中PcORPl蛋白的一個突變位點，為辣椒疫霉菌中 PcORPl蛋白的自N端起第769位氨基酸為甘氨酸與色氨酸雜合或純合的色氨酸。其中，所 述的PcORPl蛋白的白N端起第769位氨基酸也就是SEQIDNO:5中自N端起第769位氨 基酸。
[0023]上述任一所述突變位點在鑒定辣椒疫霉菌抗藥性中的應用也屬于本發明的保護 范圍；所述抗藥性為抗氟噻唑吡乙酮等PTIs殺菌劑。
[0024] 上述應用中，存在所述突變位點的辣椒疫霉菌具有或候選具有抗藥性。
[0025] 本發明提供的檢測辣椒疫霉菌對氟噻唑吡乙酮產生抗藥性的點突變的方法，對抗 性菌株進行高靈敏度、簡單快速的分子檢測，及時了解抗藥性發生動態，對制定合理的病害 管理方案、有效控制抗藥性病害發展具有重要意義。
【附圖說明】
[0026] 圖1為辣椒疫霉菌敏感和抗性菌株的序列對比。A:PcORPl基因的突變情況；B: PcORPl基因